诱导小鼠胚胎干细胞向神经细胞分化的方法技术

本发明专利技术涉及的是一种诱导小鼠胚胎干细胞（ｍＥＳＣｓ）向神经细胞分化的方法，该方法采用原代鼠胚成纤维细胞（ＰＭＥＦ）作为饲养层，取ｍＥＳＣｓ接种于饲养层上，接种于神经干细胞、ｍＥＳＣｓ培养液的混合液及神经干细胞培养液培养；逐渐更换为完全使用无血清添加碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞培养液培养。其中首次接种所用混合液的最佳血清浓度为１２．５％，首次接种ｍＥＳＣｓ的最佳接种密度为１．０×１０８Ｌ－１，完全更换为无血清培养液的时间为第５天。经本发明专利技术方法诱导，小鼠胚胎干细胞在体外可分化为神经细胞。该方法实验周期短，实验方法简便，诱导效果稳定、高效，并能快捷的完成一个细胞培养周期，利于后续实验的进行。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
一种小鼠胚胎干细胞诱导分化为神经细胞的方法，其特征在于包括如下步骤：　　（１）、饲养层细胞制备　　采用原代鼠胚成纤维细胞作为饲养层；取无菌孕１２－１５天小鼠胚胎，剪碎，然后采用重量百分含量为０．１２５－０．２５％的胰蛋白酶，２０－２５℃消化３０－６０分钟，共１－２次，用含有高糖ＤＭＥＭ和体积分数为１０％胎牛血清为培养液，置于３７℃、含体积分数为５％的ＣＯ↓［２］环境下，培养５－１０天，使用第２－４代增殖状态好的ＰＭＥＦ，加入１０ｍｇ／Ｌ的丝裂霉素Ｃ，３７℃，作用２．５小时，充分洗涤后得饲养层细胞备接种用；　　（２）、小鼠胚胎干细胞的培养　　将ｍＥＳＣｓ以１．０×１０↑［８］Ｌ↑［－１］－１．０×１０↑［９］Ｌ↑［－１］的密度接种于饲养层细胞上，置于３７℃、含体积分数为５％的ＣＯ↓［２］环境下培养，每隔２４－４８小时换ＰＭＥＦ培养液，每３－４天按１∶４～１∶６比例传代，使ｍＥＳＣｓ逐渐得到扩增和纯化；　　（３）、小鼠胚胎干细胞的诱导分化　　将扩增和纯化后的ｍＥＳＣｓ接种于无饲养层、无包被的培养板中，使用神经干细胞培养液和ｍＥＳＣｓ培养液的混合液，置于３７℃、含体积分数为５％的ＣＯ↓［２］环境下培养；换液后使用神经干细胞培养液，逐渐更换为完全使用无血清添加碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞培养液，直至第５－１０天；　　上述神经干细胞培养液，为ＤＭＥＭ－Ｆ１２，体积分数为５％胎牛血清、５％马血清和ｍＥＳＣｓ培养液含高糖ＤＭＥＭ、β－巯基乙醇、非必需氨基酸、体积分数为１５％胎牛血清，重组人白血病抑制因子，即按照ｍＥＳＣｓ培养液与神经干细胞培养液的比例１∶１培养，换液后使用神经干细胞培养液培养，逐渐更换为完全使用无血清添加浓度为１０μｇ／Ｌ碱性成纤维细胞生长因子的神经细胞培养液培养，其中含有ＤＭＥＭ－Ｆ１２、Ｎ２、Ｂ２７和碱性成纤维细胞生长因子。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：庞希宁，顾文佳，李晓丰，刘朝阳，施萍，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]