一种培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基技术

本发明专利技术公开了一种培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基。该培养小鼠胚胎干细胞的方法，是在滋养层细胞上，用胚胎干细胞培养液培养小鼠胚胎干细胞，其中，所述滋养层细胞为上皮细胞或内皮细胞。该方法中所用的培养小鼠胚胎干细胞的培养基由上皮细胞或内皮细胞和胚胎干细胞培养液组成。该胚胎干细胞培养液优选是高糖ＤＭＥＭ，１０－２０％胎牛血清或小牛血清，１．５－３．０×１０↑［－４］ｍｏｌ／Ｌ硫代甘油（Ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ，ＭＴＧ）。本发明专利技术的培养小鼠胚胎干细胞的方法，操作简便，培养成分简单，成本低廉，具有重要的应用价值和经济价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基。
技术介绍
胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES cell)也称ES细胞，是一种存在于着床前早期胚胎中的具有全能性的细胞。全能性即分化发育成三个胚层的组织细胞的能力。胚胎干细胞能在体外进行培养传代，保持未分化二倍体状态以及其全能性，具有形成嵌合体动物(chimeric animal)的能力。小鼠胚胎干细胞最早由Evans和Kaufman(1981)两人以及Martin(1981)分别从小鼠早期胚胎中分离培养成功并建立细胞系。由于其具有全能性，故广泛用于胚胎发育及胚胎工程方面的研究。例如在培养液中加入不同的分化因子，可定向诱导其分化发育成心肌细胞、淋巴细胞以及神经细胞，甚至可用它培养出器官；可用不同的外源性基因转染胚胎干细胞，或在胚胎干细胞水平上进行基因敲除或基因打靶，经体外筛选后建立带有目的基因的细胞系或将筛选后带有目的基因的胚胎干细胞注射到宿主着床前胚胎内，并移植到假孕母体子宫腔内使之发育成个体。从而建立转基因动物、基因敲除动物和基因打靶动物，研究基因在分化发育过程中的表达与调控以及制备人类疾病动物模型等。由于小鼠胚胎干细胞在体外培养过程中极易分化和失去正常二倍体核型，进而失去全能性和丧失形成嵌合体动物的能力，故需要特殊的培养条件。 胚胎干细胞体外培养的原则是在促进胚胎干细胞增殖的同时，维持其未分化二倍体状态。胚胎干细胞一旦分化即失去其全能性，失去二倍体正常核型的细胞则会大大降低形成嵌合体(chimera)的能力，特别是进入种系形成生殖细胞的能力。 目前体外培养胚胎干细胞的方法归纳起来有二大类有饲养层培养法和无饲养层培养法。无饲养层培养法则是利用各种能分泌抑制分化因子的细胞制备条件培养基，如果使用这样的条件培养基培养小鼠胚胎干细胞，可以不使用饲养层细胞，能保证小鼠胚胎干细胞增殖的同时维持未分化二倍体状态。由于无滋养层细胞培养方法在大多数实验室在长时间难以维持mES多能性。目前主要使用滋养细胞培养方法。有饲养层培养法主要应用MEF和SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌苯苷亚系STO细胞作为饲养细胞；经丝裂霉素-C或γ-射线处理终止其分裂后制备成饲养单层，将胚胎干细胞种植在这样的单层上。MEF和STO都能分泌促进胚胎干细胞增殖和抑制胚胎干细胞自主分化的因子。MEF和STO培养上清中抑制胚胎干细胞自主分化因子-LIF含量在500～1000IU/ml(分泌型)，同时在MEF和STO基质上还存在LIF(基质型)。STO细胞是已建系的SIM小鼠成纤维细胞耐硫代鸟嘌呤和耐乌本苷亚系(Hogan et al.1994)。它可以长期进行体外培养传代和冻存。但效果不如MEF而未能广泛使用。使用MEF作为饲养细胞培养胚胎干细胞是一种最早和常用的方法。MEF能产生抑制胚胎干细胞自主分化和促进胚胎干细胞增殖的因子，故它能有效地促进胚胎干细胞增殖并维持其未分化二倍体状态和全能性。通常准备12.5～14.5d怀孕小鼠制备MEF。因为第3～5代的MEF生长和各种因子分泌都旺盛，杂细胞也较少，因此选择第3～5代的MEF制备滋养层细胞。饲养细胞培养mES时，常要在培养液中加入抑制胚胎干细胞自主分化的因子-人工重组LIF。 小鼠胚胎干细胞的基础培养基是高糖的DMEM。培养液配制时，还要添加β-巯基乙醇(β-ME)或单硫甘油、谷氨酰胺、非必需氨基酸、重组的LIF和胎牛血清等多种成分。高糖的DMEM有助于囊胚的贴壁、内细胞团的增殖及小鼠胚胎干细胞集落的形成；胎牛血清是胚胎干细胞培养液中不可缺少的成分。在促进胚胎干细胞增殖方面起到很好的作用；β-巯基乙醇(β-ME)可以保护细胞内酶和蛋白质中的硫基不被氧化，从而促进胚胎干细胞的贴壁及克隆形成；LIF是六十年代末发现的一种多功能细胞因子。在体外具有诱导M1细胞(一种髓样白血病细胞，myeloid leukaemiccell)向正常分化和抑制胚胎干细胞自主分化能力，以及能够促进8细胞期以后的桑椹胚至着床前胚胎的发育，提高囊胚的存活率，促进滋胚层细胞增殖和内细胞团生长。许多组织和细胞都有LIF和LIF受体的表达，如子宫内膜、蜕膜、胚胎滋胚层细胞、胚胎成纤维细胞、人膀胱癌细胞等有LIF的表达；胚胎干细胞、M1髓样白血病细胞、巨噬细胞、胚胎瘤(癌)细胞、脂肪细胞、神经细胞等有LIF受体的表达。LIF分为两种类型分泌型(D型)和基质型(M型)。D型可分泌到细胞外液中，M型则锚定到细胞外基质上。人和鼠LIF基因有78％～94％的同源性。有用人LIF培养小鼠胚胎干细胞抑制其分化的报道，但未见有用鼠LIF培养人胚胎干细胞的报道。目前，人工重组的LIF制品已被商品化，可用来制备LIF条件培养基。LIF最适用量为1000IU/ml。当LIF浓度降至50～100单位/ml时，胚胎干细胞未分化的克隆数会下降至50％～60％。 自从mES建系以来20多年时间内，尽管小鼠胚胎干细胞体外培养技术最为成熟，但是上述培养体系仍存在如下缺点(1)操作复杂mES体外培养过程包括12.5～14.5d怀孕小鼠的准备、MEF的分离和培养、MEF滋养层细胞制备、条件培养基配制、mES的传代等。(2)MEF生命期有限，不能在体外长期传代。在体外传代时间太长，其产生促增殖因子和抑制分化因子的能力会减弱甚至丧失。这就需要经常准备12.5～14.5d怀孕小鼠制备MEF。(3)种植胚胎干细胞前，如果用丝裂霉素-C处理MEF，清洗不彻底时，残余的丝裂霉素-C会影响胚胎干细胞的增殖。(4)在胚胎干细胞培养过程中，死亡的MEF细胞的染色体释出可能会引起胚胎干细胞的突变及影响正常核型的保持。(5)培养液成分复杂在mES培养体系中，除基础培养基DMEM、胎牛血清外，需要添加β-巯基乙醇(β-ME)或硫代甘油、谷氨酰胺、非必需氨基酸、重组的LIF。同时，其中氨基酸成分、重组LIF等长时间放置易导致生物活性丧失。(6)传统的培养方法中使用孕鼠、各种氨基酸、人工重组LIF等具有非常高昂费用的生物材料和试剂，对于我国科研经费相对缺乏的国情，使得有关mES的研究工作受到极大的限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种简便、有效、低成本的培养小鼠胚胎干细胞的方法及其专用培养基。 本专利技术所提供的培养小鼠胚胎干细胞(mES)的方法，是在滋养层细胞上，用胚胎干细胞培养液培养小鼠胚胎干细胞，其中，所述滋养层细胞为上皮或内皮细胞。 所述上皮细胞或内皮细胞可来源于人和哺乳动物上皮细胞或内皮细胞。 所述上皮细胞或内皮细胞具体可来源于人和哺乳动物上皮组织或内皮细胞且具有自发分泌LIF的功能(包括自发分泌基质型LIF和分泌型LIF)。 所述上皮细胞和内皮细胞包括已建系的上皮细胞系、内皮细胞系和原代培养获得的上皮细胞及内皮细胞。 所述内皮细胞优选为人脐静脉内皮细胞、心血管内皮细胞、骨髓组织内皮细胞等；所述上皮细胞优选为人膀胱上皮组织、泌尿生殖道上皮组织、呼吸道、消化道等组织来源上皮细胞。 所述人膀胱癌上皮细胞系可为人膀胱癌上皮细胞T24；所述人脐静脉内皮细胞为人脐静脉内皮细胞系ECV-304。 人脐静脉内皮细胞系ECV-304源自1984年日本科学家从新生男婴脐静脉分离的，具有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养小鼠胚胎干细胞的方法，是在滋养层细胞上，用胚胎干细胞培养液培养小鼠胚胎干细胞，其特征在于：所述滋养层细胞为上皮或内皮细胞。

【技术特征摘要】
1.一种培养小鼠胚胎干细胞的方法，是在滋养层细胞上，用胚胎干细胞培养液培养小鼠胚胎干细胞，其特征在于所述滋养层细胞为上皮或内皮细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述上皮细胞来源于人膀胱上皮组织；所述内皮细胞来源于人脐静脉。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述上皮细胞来源于人膀胱癌上皮细胞系；所述内皮细胞来源于人脐静脉内皮细胞；所述内皮细胞包括已建系的内皮细胞和原代培养所获得的内皮细胞；所述上皮细胞包括已建系的上皮细胞和原代培养获得的上皮细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于所述人膀胱癌上皮细胞系为人膀胱癌上皮细胞T24；所述人脐静脉内皮细胞为人脐静脉内皮细胞系ECV-304。5.根据权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于所述胚胎干细胞培养液是在含有L-谷氨酰胺的高糖DMEM中，添加胎牛血清或小牛血清以及硫代甘油，使胎牛血清或小牛血清的质量百分含量为10-20％，硫代甘油的含量为1.5-3.0×10-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：周海胜，孙晓萌，邓宏魁，丁明孝，
申请(专利权)人：北京维通达生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]