为建立人类胚胎干细胞(hESC)系进行的内细胞团分离制造技术

本发明专利技术涉及一种分离内细胞团的方法，步骤包括：将含有透明带、滋养外胚层和内细胞团的胚泡阶段的胚胎固定，用激光消融在胚泡阶段的胚胎上打孔，然后通过该孔从胚泡阶段的胚胎中取出内细胞团。激光消融技术是通过非－接触式二极管实现的。从胚泡阶段的胚胎中分离出的内细胞团用来构建人胚胎干细胞系。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种采用非接触式二极管激光技术，从哺乳动物处于胚泡阶段的胚胎中分离内细胞团，从而建立人类胚胎干细胞系的方法。
技术介绍
人体干细胞的分离能产生有前景一大批新的治疗方法。人们期望从此类细胞得到的生物学治疗，即通过组织再生和修复以及通过遗传物质的靶向传递，能够治疗大范围的医学疾病。分析和评估在临床上使用人类干细胞的安全性对于这种尝试是至关重要的。胚胎干(ES)细胞是特殊类型的细胞，其既能复制自身(自我更新)，又能产生分化的功能性特化细胞类型。这些干细胞能变成身体中几乎所有的特异性体细胞，并因此可能产生一大批组织和器官如心脏、胰脏、神经组织、肌肉、软骨等的替代细胞。干细胞具有在人工培养的条件下无限分裂和增生的能力。科学家们利用干细胞的这两种性质从干细胞中生产出几乎是无限数量的绝大多数类型的人类细胞，这就为通过细胞替换来治疗疾病的方法铺平了道路。事实上，细胞治疗具有治疗任何与细胞功能障碍或损伤相关疾病的潜力，这些疾病包括中风，糖尿病，心脏病发作，脊髓损伤，癌症或AIDS等。干细胞所具有的修复或替代病态或受伤组织的治疗潜力，引起了科学、医学和/生物技术投资界的极大兴趣。来自于多种哺乳动物胚胎的ES细胞已在实验室中被成功培养。Evans和Kaufman(1981)以及Martin(1981)展示了直接从小鼠胚泡中获得的永久性的胚胎细胞系是可能的。Thomson等(1995和1996)成功地从恒河猴和狨猴获得了永久的细胞系。多能细胞系也已经从几种家畜或试验动物中预先植入的晶胚中得到，这样的动物包括牛(Evans等，1990)，猪(Evans等，1990，Notarianni等，1990)，绵羊和山羊(Meinecke-Tillmann和Meinecke，1996，Notarianni等，1991)，兔(Giles等，1993，Graves等，1993)，水貂(Sukoyan等，19992)，大鼠(Lannaccona等，1994)和Hamster(Doetschman等，1988)。最近，Thomson等(1998)和Reubinoff等(2000)报道了人类ES细胞系的获取。这些人类的ES细胞和恒河猴的ES细胞系相类似。在人类胚泡的ICM中发现了ES细胞，这是在受精后第4天到第7天，胚胎生长的早期阶段。胚泡是指在着床前胚胎发育的阶段，它包含两种细胞。1.滋养外胚层处于外层，提供额外的胚胎膜。2.内细胞团(ICM)形成胚胎本身。在正常的胚胎发育过程中，ES细胞在第7天之后消失，并开始形成三个胚胎组织层。然而，从胚泡阶段的ICM中提取的ES细胞在实验室中能够被体外培养，并在合适的条件下可以无限繁殖。在这种未分化状态下的ES细胞保持了分化成所有三个胚胎组织层细胞的能力。最后，内细胞团的细胞产生了所有的胚胎组织。在胚胎形成阶段中，即接近胚泡生长的第一周周末时，可从胚泡的ICM获得ES细胞。从胚泡中分离ES细胞并使其在培养物中生长的可能性似乎主要取决于该胚泡的完整性及其条件状况。简而言之，尺寸大且具有明显的内细胞团的胚泡易于最有效地产生ES细胞。为建立胚胎干细胞系，人们已经采用了几种方法来分离细胞内团(ICM)。大多数普通的方法如下1.胚泡的天然孵育在这种方法中，将胚泡置于培养液上进行天然孵育。胚泡的孵育通常发生在第6天。受孵育的胚泡的内细胞团(ICM)生长出生长晕(outgrowth)。采用机械方式除去该生长晕，随后使其继续生长以建立胚胎干细胞系。然而，该方法有着几个缺点。首先，滋养外胚层细胞在所提供的培养条件下增生非常快，很多情况下抑制了内细胞团的生长晕。其次，当用机械方式除去内细胞团的生长晕时，可能会将滋养外胚层细胞分开。第三，人类胚泡发生自然孵育的百分比非常低。2、显微外科方法另一种分离内细胞团的方法是被称为显微外科的机械抽吸术。在这种方法中，采用显微操作器系统，通过固定吸液管(holding pipette)夹持并放置胚泡，使内细胞团(ICM)处于9点钟的位置。采用有斜面形状的活检针抽吸内细胞团(ICM)，并将其嵌入囊胚腔中。由于分离完整内细胞团的可能性很低，且细胞多次发生解体，因此该方法的缺点是非常大的。其过程是非常乏味的，而且可能导致对胚胎的严重破坏。细胞水平上的操作要求采用具有微米精度的工具以减少破坏和污染。3、免疫外科法这是一种分离内细胞团(ICM)的常规方法。采用补体介导的细胞溶解方法分离内细胞团(ICM)。在该方法中，使胚泡曝露于酸性tyrode溶液或链霉蛋白酶溶液中，以除去胚泡的透明带(壳)。然后将无带的胚胎曝露于人类表面抗体中达30分钟到1小时。然后将胚胎曝露于豚鼠的补体中以溶解滋养外胚层。采用精细牵引(drawn)的巴斯德吸液管重复性机械式的移液方法，从内细胞团(ICM)中除去补体介导的已被溶解的滋养外胚层细胞。近期文献中报道的所有胚胎干细胞系都是通过该方法获得的。然而，该方法具有几个缺点。首先，胚胎长时间地曝露于酸性的tyrode溶液或链霉蛋白酶溶液中，导致了对胚胎的有害作用，并因此使胚胎本身的发育能力降低。其次，该方法需要花费1.5到2.0小时的时间，因此是一种很费时的方法(Narula等，1996)。第三，每一胚泡的内细胞团(ICM)的收率很低。第四，该方法中采用的抗体和补体要求苛刻的储存条件。最后，由于使用了源自于动物的抗体和补体，该方法有将源于动物的病毒和细菌传播给人类的危险。在该方法中，使用了两种动物血清，一种是兔的抗人类抗血清，另一种是豚鼠的补体血清。直到今天，我们研究的人类细胞系主要是采用免疫外科学的方法获得的，在该方法中采用了动物的抗血清和补体。现存细胞系可能存在的其它缺点如下1.在培养胚胎干细胞时需要使用饲养层细胞，从而产生混合物的细胞群，因此需要将胚胎干细胞从饲养层细胞组分中分离出来，这一过程会影响细胞的扩增。2.从饲养层细胞中产生的转录污染了胚胎干细胞(ESC)，因此不能在商业规模上加以应用，而仅能用于研究。Geron建立了一种方法，该方法中人类胚胎干细胞(hESC)系在缺乏饲养层细胞的条件下进行培养(XU等，2001)。在条件培养液(conditionedmedium)中的细胞外基质上培养hESC，使其在生长环境中以未分化状态进行扩展。hESC不包含来自培养物中其它细胞的癌源的异种成分。而且，这种hESC细胞以及其衍生物的生产方法更适合于商业化应用。在这种方法中，无须在支持培养物的工作基底(ongoing basis)上提供饲养层细胞，并可采用机械方法进行细胞传代。然而，该方法的主要缺点在于采用免疫外科方法分离内细胞团(ICM)，该免疫外科学方法中采用含有异源成分的饲养层来获得最初的胚胎干细胞。这就可能导致来源于动物的病毒和细菌的污染。为简化内细胞团分离的方法并使其安全化，本专利技术的科学家们提出一种采用非接触式激光分离内细胞团的新方法，该方法中未使用动物的抗血清和补体。在辅助繁殖中采用激光技术随着辅助繁殖技术(ART)的出现，人们已经采用几种方法来提高受精质量，促进胚泡孵育(Cohen等，1990)并进行卵裂球活检(Tarin和Handyside，1993)。通常使用的方法有化学法(Gordon和Talansky，1986)，机械法(De本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用非－接触式二极管激光技术，分离内细胞团（ＩＣＭ）从而建立人类胚胎干细胞（ｈＥＳＣ）系的方法，包括以下步骤：（ｉ）将３５ｍｍ培养皿中的胚泡置入被矿物油覆盖的５０微升常规的胚胎活检培养液中；（ｉｉ）安装微操作系统，该微操 作系统由带有加热台的显微镜，夹持固定吸液管的工具夹，抽吸吸液管和空气注射器组成；（ｉｉｉ）放置上述（ｉ）中的培养皿，将胚泡装载于上述（ｉｉ）中的加热台上，并调节胚泡，使其位于视野的中央；（ｉｖ）通过空气注射器进行抽气，用固定 吸液管固定胚泡，使其位于９点钟的位置，使被分离的内细胞团（ＩＣＭ）位于３点钟的位置。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：菲鲁扎拉杰什帕里克，萨蒂什马哈德奥罗托泰，莎伊拉贾阿努帕姆萨克塞纳，
申请(专利权)人：利莱恩斯生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：IN[印度]