本发明专利技术涉及用于纯化高分子量透明质酸的有效方法。一个实施方案涉及提供在兽瘟链球菌中生产高分子量HA的生长条件。例如，在包含更低的蛋白浓度(例如，1％酪蛋白水解物)和更高的糖浓度(例如，5％蔗糖)的培养基中生长，产生5-6g/L的高分子量HA，其范围是3.5-4.0x106Da。本发明专利技术也提供了纯化HA的有效方法，其包含用硅胶处理、然后用活性炭处理，随后用更小体积的溶剂渗滤。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及改进的用于生产和纯化透明质酸和它的盐的技术。本专利技术也涉及具有生物医学应用的透明质酸和它的盐的生产和工艺最优化和纯化。
技术介绍
透明质酸(HA)是一种在细菌和包括人类在内的高等动物中具有生物功能的天然存在的生物聚合物。天然存在的HA可以在高等动物组织中发现，尤其作为胞间隙填充物(Balazs, Viscosupplementation a new concept in the treatment ofosteoarthritis. J. Rheumatol. Suppl. ;39 :3_9, (Aug. 1993))。它在眼睛玻璃体液和关节滑液中的浓度最高(O' Regan, M.，Martini, I.，Crescenzi, F.，De Luca, C,和 Lansing,M. , Molecular mechanisms and genetics of hyaluronan biosynthesis. InternationalJournal of Biological Macromolecules 16:283-286(1994))。在革兰氏阳性的链球菌(Streptococci)中，发现它是围绕在细菌周围的粘液样荚膜。透明质酸也称作乙酰透明质酸或透明质酸盐，是一种在结缔组织、上皮组织和神经组织中广泛分布的糖胺聚糖。它是胞外基质的主要组分之一。它主要有助于细胞增殖和迁移，且也可以参与有些恶性肿瘤的进展。乙酰透明质酸天然地存在于许多身体组织中，例如皮肤、软骨和玻璃体液。因此它非常适用于靶向这些组织的生物医学应用。在二十世纪七十年代和八十年代开发了第一种乙酰透明质酸生物医学产品Healon ,并批准用于眼外科手术(即，角膜移植术、内障外科、青光眼外科手术和修复视网膜剥离的外科手术)。其它生物医学公司也生产用于眼外科手术的乙酰透明质酸品牌。乙酰透明质酸也用于治疗膝盖的骨关节炎。这样的治疗作为向膝关节中的注射过程来施用，且可以用于补充关节液的粘性，从而润滑关节、缓冲关节和产生镇痛作用。乙酰透明质酸也可以对软骨细胞具有积极的生化效应。由于它的高生物相容性和它常存在于组织的胞外基质中，乙酰透明质酸在组织工程研究中作为生物材料支架日益得到普及。在有些癌症中，乙酰透明质酸水平与恶性肿瘤和预后差非常相关。乙酰透明质酸可以用作前列腺癌和乳腺癌的肿瘤标记。它也可以用于监控这些疾病的进展。乙酰透明质酸也可以在手术后用于诱导组织愈合，特别在内障外科后。现有的伤口愈合模型提出，更大的透明质酸聚合物出现在愈合早期，以在物理上为介导免疫应答的白细胞腾出空间。乙酰透明质酸是皮肤护理产品中的常见成分。术语“透明质酸盐”是指透明质酸(HA)的共轭碱。因为该分子通常以它的聚阴离子形式存在于体内，所以它最常见地称作“乙酰透明质酸”。HA包含由通过￠1-3和￠1-4糖苷键交替连接的葡糖醛酸(GlcUA)和N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)组成的线性的、不分支的、聚阴离子二糖单元，如图I所示。HA是糖胺聚糖家族的成员，该家族包括硫酸软骨素、硫酸皮肤素(dermatin sulphate)和硫酸乙酰肝素。不同于该家族的其它成员，它不共价结合蛋白。 在中性水溶液中，由于氢键形成，水分子和邻近的羧基和N-乙酰基赋予聚合物构象劲度，这限制了它的柔性。氢键形成导致聚合物的独特的水结合和保留能力。因而也断定，水结合能力与该分子的分子量直接相关。已知每克HA可以结合最高达6升水(Sutherland, Novel and established applications of microbial polysaccharides.Trends Biotechnoll6 :41-46,1998)。已经广泛研究了透明质酸(HA)和它的衍生物在生物医学实践中的应用。该聚合物的生物相容性特征已经引起矫形外科的注意，因为它可以用于粘稠物质手术，并允许外科医生在组织之间安全地产生间隙。从HA构建粘稠物质手术植入物(Balazs，Aug 1993，同前)。HA的粘弹性特征已经用于补充关节中的润滑。其也已经用于作为微囊的靶向药物递送。最后，因为它的高水保留能力，该EPS(胞外多糖)也在盈利的化妆品市场上占有一席之地。在2003年，FDA批准乙酰透明质酸注射剂用于填充软组织缺陷，例如面部皱纹。Restylane 是该产品的常见商品名称。乙酰透明质酸注射剂通过增加皮肤下容积来暂时平滑皱纹，效果通常持续6个月。另外，HA溶液的特征在于粘弹性和假塑性。甚至在该聚合物的非常稀的溶液(其中形成非常粘稠的凝胶)中，也发现了这些特征。通过HA的浓度和分子量，控制对于它作为生物材料的用途重要的HA溶液的粘弹性性质。来自不同来源的HA的分子量相差很大，其范围从IO4至107Da。随着它的产生经细胞膜挤出HA，这允许不受拘束的聚合物延伸，这可以导致产生非常高分子量的HA。分子量是最影响基于透明质酸的医学设备的物理性质的参数。分子量影响透明质酸溶液的粘度对浓度概况，且在它的其它粘弹性性质中起重要作用。具体地，如果分子量增力口，其治疗功效需要给定粘度的溶液要求更低的透明质酸浓度。已经表明，这为眼和矫形外科应用提供优点。能产生具有大于750，000道尔顿的分子量的医学级透明质酸的方法因而具有显著的商业潜力。在许多医药应用中，不希望在制剂中具有低分子量透明质酸，例如考虑到在美国专利号4，141，973中报道的低分子量HA的炎性作用。透明质酸用于有些销售得非常好的商业化产品，包括SynviSC (Genzyme)、Orthovisc (Anika)、Seprafilm(Genzyme)> Restylane(Q-Med)、Healon(Pharmacia)、Amvisc(Med-Chem)等。但是，由于它的高成本,它仅以非常低的浓度用于这些产品中。HA具有比其它微生物EPS更高的商业价值。估计它的世界市场价值是5亿美元，每千克售价约10万美元。已经常规地从公鸡冠和牛玻璃体液提取HA。但是，难以以工业上可行的速率从这些来源分离高分子量HA，因为它与在动物组织中存在的蛋白聚糖形成复合物(O' Regan等人，1994)。当它在动物组织中合成时，控制生物聚合物的分子量目前是不实际的。此外，动物衍生的生化试剂用于人治疗的用途已经产生了伦理问题，且遇到与日俱增的阻力。除了伦理问题以外，存在与动物衍生的生化试剂用于人治疗的用途有关的潜在传染病危险。在可以从动物组织得到IOMDa链的条件下，有相当大的提高范围。面讨论的缺点已经迫使エ业上采用细菌发酵方法，希望得到商业上可行的生物聚合物。使用细菌发酵方法，HA被释放进生长培养基，它辅助控制聚合物特征，并导致提高的HA得率。通过上述途径可以生产的生物聚合物的量在理论上是无限的。但是，细菌发酵的应用确实具有缺点。最近的趋势是使用Lancefield氏A和C组链球菌，它天然地生产HA的粘液样荚膜。HA荚膜是能使该革兰氏阳性细菌避免宿主免疫防御的生物相容性因子，且是它的特征性高毒力水平的原因。使用细菌的提取和纯化方法中的以前的后续提高已经导致HA的固有的分子量降低。链球菌发酵已经仅能生产范围为l_4MDa的平均分子量的HA。如上面所讨论的，高分子本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：V·兰加斯瓦米，V·桑托什，J·达门德拉，V·纳塔拉，H·维兰卡，A·卡帕特，
申请(专利权)人：利莱恩斯生命科学有限公司，
类型：发明
国别省市：
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