低分子量透明质酸的制备方法及工程菌技术

本发明专利技术涉及了一种低分子量透明质酸的制备方法及工程菌，本发明专利技术利用同源重组技术将兽疫链球菌中的乳酸脱氢酶编码基因进行无缝敲除，获得ldh基因敲除的重组菌。本发明专利技术将敲除ldh基因的重组菌进行发酵分析，将发酵液预处理后利用特性黏度法测定HA的分子量，得到平均分子量为0.4×106Da的HA，本发明专利技术通过微生物发酵就可以直接在发酵液中分离获得低分子量的HA，成本低，易于形成规模化工业生产。

【技术实现步骤摘要】
低分子量透明质酸的制备方法及工程菌
本专利技术属于透明质酸生产领域，尤其是一种低分子量透明质酸的制备方法及工程菌。
技术介绍
透明质酸（HA）是一种高分子直链聚糖，是由D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺组成的高级多糖，D-葡萄糖醛酸及N-乙酰葡糖胺之间由β-1,3-糖苷键相连，双糖单位之间由β-1,4-糖苷键相连。HA及其盐广泛分布于机体的各种组织中，具有特殊的生理功能，具体表现为：保水作用、润滑作用、对细胞的保护作用、对组织和血管生成的作用、对肿瘤的防治作用、对创伤愈合和止血等方面的作用，由于这些生理功能，HA被广泛应用于日化用品、食品保健、美容整形及医药等领域。HA最早发现于动物组织，后来发现是链球菌荚膜的主要成分，HA的生产也相应经历了组织提取和发酵生产两个阶段。与提取法相比，微生物发酵法不受动物原料限制，适合规模化生产。随着生物合成HA关键酶基因的克隆，构建基因工程菌成为提高产量并控制分子量的研发热点。微生物发酵法生产透明质酸较之动物组织提取法具有原料易得、成本低、有不同阶段的分子量和更高的产量的优点，使其成为透明质酸发展的方向。在兽疫链球菌中，一些用于HA合成的前体如1-P-葡萄糖、UDP-葡萄糖和UDP-N-乙酰氨基葡萄糖胺同时也用于合成细胞壁(约占细胞干重的20%，w/w)，即HA合成和细胞生长之间存在着对碳源的竞争性关系，这是兽疫链球菌发酵生产HA的一个很重要的代谢特性，同时部分碳源(果糖)进入糖酵解途径(产能途径)，其主要代谢产物为乳酸，乳酸对细胞生长和HA合成有较强的抑制作用，因此如何有效转变细胞的产能途径以降低乳酸对细胞生长和HA合成的抑制作用对于提高整个发酵过程的生产强度和生产效率具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种低分子量透明质酸的制备方法及工程菌，本方法利用同源重组技术获得ldh的基因敲除菌株，不用插入筛选标记，无缝定点敲除ldh基因，不影响其上游和下游基因的转录水平，保证透明质酸的产量，其菌株发酵获得平均分子量为0.4×106Da的透明质酸。本专利技术实现目的的技术方案如下：一种乳酸脱氢酶编码基因的左臂右臂连接序列，基因序列如序列3所示。一种包含乳酸脱氢酶编码基因的左臂右臂连接序列的载体。而且，所述载体为pSET4s::sacB::ldh-LR，载体中包括sacB基因。一种将敲除载体转入到宿主菌，特异性无缝敲除乳酸脱氢酶编码基因ldh，获得乳酸脱氢酶基因功能缺失的工程菌株。而且，工程菌的宿主菌为兽疫链球菌（Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920。而且，所用发酵培养基：蔗糖50g/L，酪蛋白胨10g/L，酵母提取物3.5g/L，K2HPO42g/L，NaCl1.5g/L，MgSO4·7H2O0.4g/L。而且，发酵条件：3L发酵液，接种量8%，37℃，pH7.0，通气量3vvm，发酵24h。一种兽疫链球菌中ldh左臂806bp基因ldh-L，所述基因序列见序列1。一种兽疫链球菌中ldh右臂831bp基因ldh-R，所述基因序列见序列2。一种兽疫链球菌中ldh左臂右臂1637bp重叠基因ldh-LR，所述基因序列见序列3。一种含有ldh-LR基因的敲除载体。一种敲除ldh基因的工程菌株。而且，含有ldh-LR基因的载体为pSET4s::sacB::ldh-LR。而且，所述的工程菌株为兽疫链球菌StreptococcuszooepidemicusATCC39920。本专利技术的优点和积极效果如下：1、本专利技术利用同源重组技术获得ldh的基因敲除菌株，不用插入筛选标记，无缝定点敲除ldh基因，不影响其上游和下游基因的转录水平，保证透明质酸的产量，其菌株发酵获得分子量为33-45万道尔顿的透明质酸。2、本专利技术将敲除ldh基因的工程菌进行发酵分析，将发酵液预处理后利用特性黏度法测定HA的分子量，得到平均分子量为0.4×106Da的HA。3、本专利技术通过微生物发酵就可以直接在发酵液中分离获得低分子量的HA，成本低，易于形成规模化工业生产。附图说明图1为本专利技术载体pSET4s::sacB的构建图谱；图2为本专利技术构建载体pSET4s::sacB的PCR验证图，M：DNAMarker；1：以Pcm-sacB片段为模板的阳性对照,扩增获得Pcm-sacB片段，大小为1686bp；2：阴性对照；3、4、6、7：Pcm-sacB片段没有连接到载体pSET4s上的菌株；5、8、9：Pcm-sacB片段成功连接到载体pSET4s上的菌株，扩增获得Pcm-sacB片段，大小与阳性对照同为1686bp；图3为本专利技术敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR的构建图谱；图4为本专利技术构建敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR的PCR验证图，M：DNAMarker；1：阴性对照；2：以ldh-LR片段为模板的阳性对照，扩增获得ldh-LR片段，大小为1637bp；3、4：片段成功连接到载体上的菌株，扩增获得ldh-LR片段，大小为1637bp，与阳性对照相同；图5为本专利技术ldh敲除菌株筛选的同源重组原理图；图6为本专利技术ldh基因敲除菌株PCR验证图，M：DNAMarker；1：阴性对照；2：野生型；3～8、10：没有发生同源重组的菌株；9、11～14：发生同源重组的菌株；图7为本专利技术将ldh敲除菌株发酵处理后利用特性黏度法测定HA分子量的图谱。具体实施方式下面结合实施例，下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。本专利技术利用同源重组技术将兽疫链球菌中的乳酸脱氢酶编码基因（lacticdehydrogenase，ldh）进行无缝敲除，获得乳酸脱氢酶基因功能缺失的工程菌株，本专利技术的内容包括：构建带有sacB筛选标记的敲除载体，构建所述ldh敲除载体的方法，构建ldh基因敲除菌株的方法。所述载体为pSET4s(GenBank:AB0556.1),载体中包括sacB基因。本专利技术所述的ldh-L来源于兽疫链球菌（Streptococcuszooepidemicus），菌株保藏编号为ATCC39920，其核苷酸序列如序列1所示；ldh-R来源于兽疫链球菌（Streptococcuszooepidemicus），菌株保藏编号为ATCC39920，其核苷酸序列如序列2所示。所述的ldh-LR是ldh-L、ldh-R连接在一起的序列，是以ldh-L、ldh-R为模板通过重叠PCR技术扩增得到的，其核苷酸序列如序列3所示。所述的敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR是分别将sacB片段、ldh-LR片段插入到初始载体pSET4s，构建了敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR，并将它电转进入兽疫链球菌中，得到ldh基因敲除菌株。上述菌株经发酵培养后，取不同培养时间的发酵液进行HA分子量的检测，平均分子量为0.4×106Da。枯草芽孢杆菌sacB基因编码分泌型蔗糖果聚糖酶，该酶能催化蔗糖水解和合成高分子量的果聚糖。高分子量果聚糖积累对细胞存在潜在的毒性作用，可造成细胞死亡。也就是说，sacB基因使得细菌获得蔗糖敏感的特性。本研究已发现在5%或5%以上的蔗糖存在下，sacB基因的表达可以导致兽疫链球菌ATCC399920死亡。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳酸脱氢酶编码基因的左臂右臂连接序列，其特征在于：基因序列如序列3所示。

【技术特征摘要】
1.一种获得产低分子量透明质酸工程菌的方法，其特征在于：⑴构建重叠基因ldh-LR，ldh-LR基因序列见序列3，构建带有sacB筛选标记的敲除载体pSET4s::sacB::ldh-LR，所述基因sacB的序列见序列4；⑵将载体pSET4s::sacB::ldh-LR转进入兽疫链球菌S...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘浩，孙夏青，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12