本发明专利技术公开了一种通过理性调控生产不同分子量透明质酸的方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术采用兽疫链球菌来源的透明质酸合酶hasA整合于枯草芽孢杆菌基因组上表达，同时，对枯草芽孢杆菌中UDP-GlcA和UDP-GlcNAc合成途径的基因，进行模块化组装表达分析，通过控制不同的UDP-GlcA和UDP-GlcNAc浓度，实现枯草芽孢杆菌产不同分子量范围的透明质酸。本发明专利技术为高效制备特定分子量范围的透明质酸奠定了一定的基础，适合于工业化生产应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，属于生物工程技 术领域。
技术介绍
透明质酸（hyaluronic acid，简称HA)，又名玻璃酸，是Meyer和Palmer于1934年 首先从牛眼玻璃体中分离出的一种高粘性物质，以其独特的分子结构和理化性质，使其具 有良好的保湿性、粘弹性、渗透性和延展性，是目前发现的自然界中保湿性最好的物质。HA 是由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸以β-(1-3)和β-(1-4)糖苷键连接的双糖单位 重复连接组成。根据不同的生物学功能，HA按照分子量大小可分为三类：大分子HA(分子 量彡L OXlO6);中分子HA(〈L OX IO4?L OXlO6)以及小分子量HA(彡L OXlO4)。其中， 大分子量的HA和中分子量的HA已经广泛应用于医学领域和化妆品领域，而小分子量HA由 于能被人体吸收，用于人体自身HA等多糖合成的前体，因而在食品保健领域具有重要的应 用前景。 HA广泛地存在于各种动物组织内，如鸡冠、关节滑液、软骨、眼玻璃体等，同时发现 HA也存在于产气杆菌、绿脓杆菌和A、B、C溶血性链球菌等部分细菌中。由于动物提取工 艺复杂、效率低以及存在病毒种间交叉感染和其它风险性的感染，近些年以来，透明质酸的 获取已经普遍由传统的动物组织提法转变为微生物发酵法，而应用最广的是致病性弱的溶 血性链球菌C族菌，如Streptococcus equi和S. zooepidemicus。随着DNA重组技术、DNA 测序技术以及代谢工程的发展，构建重组工程菌株合成HA也引起了广泛关注。不同课题组 已经在大肠杆菌（Escherichia coli)、乳酸乳球菌（Lactoccus Iactis)中进行了 HA合成 途径的构建。然而，不管动物组织提取还是微生物代谢合成HA所获得的产物分子量范围不 一，相差甚大，这给所需特定分子量范围的HA使用带了一定的困难，特别是给HA的产品质 量带来较大的影响。因此，如何构建微生物重组菌株合成不同分子量HA、尤其是特定范围分 子量的HA已经成为迫切需要解决的问题。 基于食品安全和医疗卫生越来越高的要求，本专利技术应用食品安全级的枯草芽孢杆 菌发酵生产HA。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)由于诸多优势（如安全、好氧生长、 营养条件低、遗传操作工具完善等）也已被用于HA合成途径的构建。在过去几年里，虽然 微生物发酵合成HA已经获得普遍的应用，然而获得的HA的分子量差别较大，而关于如何在 食品级工程菌株BaciIlus subtilis中通过基因工程技术直接发酵获得不同分子量范围的 HA尚无报道。同时，构建合成不同分子量范围HA的重组菌株的前提是对微生物HA分子量 调控机理的解析。 在微生物体内由6-磷酸葡萄糖途径合成UDP-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA)，由6-磷 酸葡萄糖变构为6-磷酸果糖途径合成UPD-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)，再由这两个 前体物质m)P-GlcNAc和UDP-GlcA交替作为底物，通过透明质酸合酶hasA合成透明质酸并 分泌到胞外。本专利技术通过对HA的两个前体物质UPD-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)和 UDP-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA)的合成途径进行模块化调控表达，进而引起胞内HA两个前 体物浓度的变化，最终引起HA分子量及产量的变化。该专利技术操作过程简单，且产品分子量 较集中，易于实现工业化生产制备特定分子量范围的透明质酸。
技术实现思路
本专利技术提供了一种产透明质酸的重组枯草芽孢杆菌，是在重组表达透明质酸合酶 的基础上，强化透明质酸前体物质UPD-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-GlcNAc)或UDP-D-葡萄糖 醛酸（UDP-GlcA)的合成途径。 所述强化UPD-N-乙酰氨基葡萄糖（UDP-G1 cNAc)合成途径，是重组表达编码 UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因 glmU，或glmU与编码变位酶的基因 glmM，或glmU 与glmM、编码乙酰氨基转移酶的基因 glmS，或glmU与glmM、glmS及编码磷酸葡萄糖异构酶 的基因 Pgi。 所述强化UDP-D-葡萄糖醛酸（UDP-GlcA)的合成途径，是重组表达编码UDP-葡萄 糖脱氢酶的基因 tuaD，或tuaD与编码尿苷二磷酸（UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶的基因 gtaB， 或tuaD与gtaB、编码葡萄糖磷酸变位酶的基因 pgcA。 所述透明质酸合酶编码基因 hasA可以来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)、马链球菌(Streptococcus equi)或类马链球菌(Streptococcus equissp)。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述透明质酸合酶的基因 hasA来源于兽疫链 球菌，核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。 所述葡萄糖磷酸变位酶、尿苷二磷酸（UDP)-葡萄糖焦磷酸化酶、UDP-葡萄糖 脱氢酶、磷酸葡萄糖异构酶、乙酰氨基、变位酶和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶可以 来源于链球菌属（Streptococcus species)、大肠杆菌（Escherichia coli)和芽抱杆菌 (Bacillus)。在本专利技术的一种实施方式中，编码上述所述途径酶的基因来源于枯草芽孢杆 菌（Bacillus subtilis);编码所述UDP-葡萄糖脱氢酶（tuaD)、尿苷二磷酸（UDP)-葡萄 糖焦磷酸化酶（gtaB)、葡萄糖磷酸变位酶（pgcA)、磷酸葡萄糖异构酶（pgi)、乙酰氨基转移 酶（glmS)、变位酶（glmM)和UDP-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶（glmU)的核苷酸序列分别为 SEQ ID NO. 2-8 所示。 在本专利技术的一种实施方式中，重组表达基因时采用的载体可以为枯草芽孢杆菌游 离型表达载体或者整合基因组用载体。本专利技术的一种实施方式是将透明质酸合酶基因 hasA 整合到枯草芽孢杆菌的基因组中进行表达，采用游离型载体PP43NMK表达UDP-GlcNAc和 UDP-GlcA合成途径的基因。 在本专利技术的一种实施方式中，重组表达基因时，游离型表达载体上采用组成型启 动子P43(核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示），基因组重组表达时采用木糖诱导型启动子 Pxyl (核苷酸序列如SEQ ID NO. 10所示）。 在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis 168。 本专利技术提供了一系列重组枯草芽孢杆菌，适用于生产不同分子量的HA : 采用木糖诱导型启动子Pxyl在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达hasA，进一步以 PP43NMK载体表达glmU，发酵培养重组菌ZHA168/pP43NMK/glmU可生产平均分子量约为150 万道尔顿的HA。 采用木糖诱导型启动子Pxyl在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达hasA，进一步以 PP43NMK载体串联表达glmU、glmM，发酵培养重组菌株ZHA168/pP43NMK/glmU-glmM可以生 产平均分子量为200万道尔顿的HA。 采用木糖诱导型启动子Pxyl在枯草芽孢杆菌基因组上整合表达h本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种产透明质酸的重组枯草芽孢杆菌，是在重组表达透明质酸合酶的基础上，强化透明质酸前体物质UPD‑N‑乙酰氨基葡萄糖或UDP‑D‑葡萄糖醛酸的合成途径。
【技术特征摘要】
1. 一种产透明质酸的重组枯草芽孢杆菌，是在重组表达透明质酸合酶的基础上，强化 透明质酸前体物质UPD-N-乙酰氨基葡萄糖或m)P-D-葡萄糖醛酸的合成途径。2. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述UDP-D-葡萄糖醛酸合 成途径包括编码UDP-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，编码尿苷二磷酸（UDP)-葡萄糖焦磷酸化 酶的基因gtaB，编码葡萄糖磷酸变位酶的基因pgcA ;所述UPD-N-乙酰氨基葡萄糖的合成途 径包括编码M)P-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，编码变位酶的基因glmM，编码乙 酰氨基转移酶的基因glmS，编码磷酸葡萄糖异构酶的基因pgi。3. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，在重组表达编码透明质酸 合酶的基因的基础上，重组表达编码M)P-葡萄糖脱氢酶的基因tuaD，或tuaD与编码尿苷二 磷酸⑴DP)-葡萄糖焦磷酸化酶的基因gtaB，或tuaD与gtaB、编码葡萄糖磷酸变位酶的基 因 pgcA。4. 根据权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，在重组表达编码透明质酸 合酶的基因的基础上，重组表达编码M)P-N-乙酰氨基葡糖焦磷酸化酶的基因glmU，或glmU 与编码变位酶的基因glmM，或glmU与glmM、编码乙酰氨基转移酶的基因glmS，或glmU与 glmM、glmS及编码磷酸葡萄糖异构酶的基因pgi。5. 根据权利要求1-4任一所述的重组枯草芽孢杆菌，其特征在于，所述透明质酸 合酶编码基因hasA来源于兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus)、马链...
【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，堵国成，金鹏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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