有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株制造技术

一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，其属于大肠杆菌，且含有：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株染色体上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、及araE基因；一araBAD启动子，为可操作地连接至染色体上的T7RNA聚合酶基因；及一T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质基因。而且，菌株缺少araABD基因操纵组、及araFGH基因操纵组。

【技术实现步骤摘要】
有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株
本专利技术关于一种利用基因工程技术建构的菌株，且特别关于一种有氧下可提升重 组蛋白质表现的大肠杆菌菌株。
技术介绍
细胞内的蛋白质表现为一耗能的生理现象，而消耗的能量大多由细胞摄取、代谢 的碳源所供应。因此，若欲提升细胞内重组蛋白质的表现量，细胞须大量摄取并代谢碳源。 葡萄糖因容易摄取、代谢，故为这些碳源中最为常见者。 大肠杆菌代谢葡萄糖时，葡萄糖会抑制乳糖、蜜二糖、麦芽糖、与甘油等碳源的穿 透酶活性，使菌体无法代谢这类碳源。这过程称为「诱导物排除（inducer exclusion)」。 同时，葡萄糖亦会抑制环化酶（adenylyl cyclase)活性，使环化酶无法催化三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate, ATP)成环腺苷酸（cyclic adenosine monophosphate, cAMP) 〇 环化酶活性的抑制造成菌体内环腺苷酸的含量降低，从而抑制木质糖、阿拉伯糖、鼠李糖、 与半乳糖等碳源的穿透酶基因与代谢基因表现，让菌体无法代谢此类碳源。此过程称为「分 解代谢物阻抑（catabolite repression)」。 于具T7表现系统（T7expression system)的大肠杆菌内，因分解代谢物阻抑会抑 制表现系统的Iac基因操纵组的启动子活性，以间接向下调控（down regulate)重组蛋白 质的表现量。为解决此问题，J Agric Food Chem. 2011 ;59(12) :6534-42已建构一株新颖 大肠杆菌菌株，命名为BAD5。阿拉伯糖于有氧下能诱导菌株BAD5表现重组蛋白质。然而， 菌株BAD5无法有效代谢葡萄糖以外的碳源，故不能产生足够的能量，以致限制重组蛋白质 的表现量。申言之，菌株BAD5的重组蛋白质表现量无法满足业界需求。
技术实现思路
本专利技术的第一构想提出一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，其属于大肠杆 菌，且包含：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株的染色体上的glpF基因、gldA 基因、dhaKLM基因操纵组、及araE基因；一 araBAD启动子，为可操作地连接至染色体上的 T7RNA聚合酶基因；以及一 T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质基因。而且，菌株缺 少araABD基因操纵组、及araFGH基因操纵组。 本专利技术的第二构想提出一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，此属于大肠杆 菌，且包含：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株的染色体上的glpF基因、gldA基 因、dhaKLM基因操纵组、araE基因、galP基因、及glk基因；一 araBAD启动子，为可操作地 连接至染色体上的T7RNA聚合酶基因；以及一 T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质 基因。而且，菌株缺少araABD基因操纵组、araFGH基因操纵组、及ptsG基因。 【附图说明】 图1说明着大肠杆菌的甘油无氧代谢、甘油有氧代谢、及葡萄糖有氧代谢；图中符 号说明为：十，活化基因的表现；Θ，抑制基因的表现； 图2为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳图，以说明菌株生产的可溶性蛋白质；其 中，径Μ，蛋白质标准物；径1，重组菌株BAD5/pChHDT生产的可溶性蛋白质；径2,重组菌株 N30/pChHDT生产的可溶性蛋白质；箭头，D-HDT ; 图3显不菌株N30的液态培养基于不同时间培养后的葡萄糖与甘油浓度； 图4显不菌株N3〇-Gal的液态培养基于不同时间培养后的葡萄糖与甘油浓度； 图5为非原态硫酸十二酯钠-聚丙烯酰胺电泳图，以说明菌株生产的蛋白质；其中，径 M，蛋白质标准物；径1，重组菌株N30-Gal(<ji80-TrHDT)生产的可溶性蛋白质；径2,重组菌 株Ν30(Φ80-Τι·Η?Τ)生产的可溶性蛋白质；径3,重组菌株N30-Gal((ji80-TrHDT)生产的不 可溶性蛋白质；径4,重组菌株Ν30(Φ80-Τι·Η?Τ)生产的不可溶性蛋白质；箭头，融合蛋白质 TrxA/D-HDT〇 具体实施例 为让本专利技术更明显易懂，文中使用的基因全名于下：araA，阿拉伯糖异构酶 (arabinose isomerase) ;araB，核酮糖激酶（ribulokinase) ;araD，核酮糖 _5_ 憐酸 _4_ 表 异构酶（ribulose 5-phosphate 4-epimerase) ;araE，阿拉伯糖转运蛋白（arabinose transporter) ;araFGH，阿拉伯糖转运蛋白（arabinose transporter) ;dhaKLM，二轻基丙 酮激酶（dihydroxyacetone kinase) ;galP，半乳糖穿透酶（galactose permease) ;gldA， 甘油脱氢酶（glycerol dehydrogenase) ;glk，葡萄糖激酶（glucokinase) ;glpF，传送甘油 的辅助蛋白（glycerol uptake facilitator protein) ;ptsG，葡萄糖磷酸转移酶系统穿透 酶（glucose phosphotransferase system permease)〇 请参照图1，大肠杆菌的甘油代谢可分为：有氧代谢及无氧代谢。于有氧代谢中， 先将甘油转变成甘油-3-磷酸（glycerol-3-phosphate，G3P)，接着将甘油-3-磷酸转变为 二轻丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate, DHAP)。于无氧代谢中，先将甘油转化为二轻 基丙酮（dihydroxyacetone, DHA)，再将二轻基丙酮转化成二轻丙酮磷酸。由上可知，glpF 基因、gldA基因、及dhaKLM基因操纵组的启动子可能为缺氧（hypoxia)相关的调控件。若 替换这些启动子为其它与缺氧无关的调控件，则可能于有氧下同时进行甘油有氧代谢与甘 油无氧代谢。透过此方式，当菌体于有氧下表现重组蛋白质时，可利用甘油此等代谢方式所 产生的能量。 于是，本专利技术的第一实施方式提出一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株。 此菌株属于大肠杆菌，且包括：至少一非内源启动子，为可操作地连接至菌株染色体上的 glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、及araE基因；一 araBAD启动子，为可操作地连 接至染色体上的T7RNA聚合酶基因；以及一 T7启动子，为可操作地连接至一重组蛋白质基 因。此外，此菌株缺少araABD基因操纵组、及araFGH基因操纵组。 文中使用的「非内源启动子」乙词意指,一非自然（non-naturally)连接于一基因 的启动子，其实例可以为但不限于EM7启动子、Trc启动子、或λ噬菌体PR启动子。文中 使用的「可操作地连接（operably linked)」片语意指,二核酸片段相当接近,且其中一者可 影响另一者。 于本实施方式中，连接至glpF基因的非内源启动子为Trc启动子,连接至gldA基 因的非内源启动子为λ噬菌体PR启动子，连接至dhaKLM基因操纵组的非内源启动子为λ 噬菌体PR启动子，且连接至araE基因的非本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，属于大肠杆菌，其特征在于，且包括：至少一非内源启动子，可操作地连接至该菌株的染色体上的glpF基因、gldA基因、dhaKLM基因操纵组、及araE基因；一araBAD启动子，可操作地连接至该染色体上的T7 RNA聚合酶基因；以及一T7启动子，可操作地连接至一重组蛋白质基因；其中，该菌株缺少araABD基因操纵组、及araFGH基因操纵组。

【技术特征摘要】
1. 一种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，属于大肠杆菌，其特征在于，且包括： 至少一非内源启动子，可操作地连接至该菌株的染色体上的glpF基因、gldA基因、 dhaKLM基因操纵组、及araE基因； 一 araBAD启动子，可操作地连接至该染色体上的17 RNA聚合酶基因；以及 一 17启动子，可操作地连接至一重组蛋白质基因； 其中，该菌株缺少araABD基因操纵组、及araFGH基因操纵组。2. 如权利要求1所述的菌株，其特征在于，该非内源启动子选自于由EM7启动子、Trc 启动子、及A噬菌体匕启动子所组成的群组。3. 如权利要求1所述的菌株，其特征在于，该连接至基因的非内源启动子为Trc 启动子，该连接至W说基因的非内源启动子为A噬菌体PK启动子，而该连接至基 因操纵组的非内源启动子为A噬菌体匕启动子。4. 如权利要求3所述的菌株，其特征在于，该连接至^7#基因的非内源启动子位于该 ^7#基因的上游区域，该连接至W说基因的非内源启动子位于该W说基因的上游区域，而 该连接至基因操纵组的非内源启动子位于该基因操纵组的上游区域。5. 如权利要求1所述的菌株，其特征在于，该重组蛋白质基因位于该菌株的染色体上， 或位于该菌株内的一质体中。6. 如权利要求1或5所述的菌株，其特征在于，该17启动子位于该重组蛋白质基因的 上游区域。7. -种有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株，属于大肠杆菌，其特征在于，且包括： 至少一非内源启动子，可操作地连接至该菌株的染色...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云鹏，姜中人，何宜静，王祉雯，
申请(专利权)人：逢甲大学，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71