本发明专利技术公开了一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术所提供的基因工程菌是共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS，同时过表达乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB。同时本发明专利技术还提供了基因工程菌的构建方法。本发明专利技术所提供的基因工程菌能够以乙酸为原料合成甲羟戊酸，具有生产成本低，产量高的特点，适用于产业化推广。
【技术实现步骤摘要】
一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌及其构建方法与应用，属于基因工程
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技术介绍
甲羟戊酸是生物体内生成异物烯焦磷酸(IPP)的中间代谢产物，是合成留醇、萜类、类异戊二烯的重要中间体，同时，在化工行业也有重要的用途。目前，甲羟戊酸合成主要有酶法合成、生物催化和化学催化相结合合成、化学合成等方法，但存在步骤繁琐、收率过低或不适于产业化制备等问题。经微生物发酵合成甲羟戊酸，反应条件温和，环境友好，可很好的解决以上问题。 目前生物法合成甲羟戊酸，主要以葡萄糖为碳源，经过糖酵解，产生丙酮酸；丙酮酸在丙酮酸脱氢酶系的作用下生成乙酰辅酶A ；乙酰辅酶A进入甲羟戊酸代谢途径，在乙酰乙酰-辅酶A硫解酶，HMG-CoA合酶及HMG-CoA还原酶的催化剂下生成甲羟戊酸。研究者已经在大肠杆菌内过表达乙酰乙酰-辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因(mvaE)以及HMG-CoA合酶基因OwaS)，以葡萄糖为碳源进行发酵，最终甲羟戊酸产量能够达到47g.^(Tabataet al., B1technology Letters 26, 1487-1491, 2004) ? 然而，由于葡萄糖成本较高，限制了生物法的广泛应用，寻找更廉价的碳源，降低生物法制备甲羟戊酸的成本是现有技术亟待解决的问题。 乙酸作为一种价廉易得的可替代碳源，从工业废液中回收乙酸，作为工程大肠杆菌的碳源，发酵生产甲羟戊酸，既可回收利用资源，又可减轻环境污染，同时还能降低生产成本，具有广阔的应用前景。乙酸在大肠杆菌体内的代谢途径，有2种代谢方式，一是以由乙酰辅酶A合成酶(ACS)催化生成乙酰辅酶A，一是由乙酸激酶(ACK)和磷酸转乙酰酶(PTA)催化生成乙酰辅酶A (Alan J.Wolfe, Microb1l.Mol.B1l.Rev.2005，69 (I): 12-50)。但目前尚没有利用乙酸发酵生成甲羟戊酸的菌株报道，以乙酸为原料生物合成甲羟戊酸是否可行尚无法确定。
技术实现思路
为解决以葡萄糖为原料生产甲羟戊酸成本过高的问题，本专利技术提供了一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌，所采取的技术方案如下: 本专利技术的目的之一在于提供一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌，该基因工程菌是共表达乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS,同时过表达乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB。 上述基因可来源于化学合成、扩增自微生物或扩增自重组质粒。 优选地，所述乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因meaB，来源于枯草芽孢杆囷、烟曲霉囷或大肠杆囷。 优选地，乙酰辅酶A合成酶基因acs来自大肠杆菌的，Gene ID =12933681 ;所述苹果酸酶基因meaB，来自大肠杆菌的，Gene ID: 12931931。 本专利技术的另一目的在于提供了一种所述基因工程菌的构建方法，该方法的步骤如下: I)获得乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE、HMG-CoA合酶基因mvaS、乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB ； 2)构建含有乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS的重组质粒； 3)构建含有乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB的重组质粒； 4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主菌中，获得基因工程菌。 所述方法中乙酰辅酶A合成酶基因acs和苹果酸酶基因meaB,来源于枯草芽孢杆囷、烟曲霉囷或大肠杆囷。 所述方法中所述乙酰辅酶A合成酶基因acs优选来源于大肠杆菌的，Gene ID:12933681 ;所述苹果酸酶基因meaB优选来源于来自大肠杆菌的，Gene ID:12931931。 所述方法的具体步骤如下: I)获得乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE、HMG-CoA合酶基因mvaS、乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB ； 所述乙酰辅酶A合成酶基因acs,优选来自大肠杆菌，Gene ID:12933681 ;所述苹果酸酶基因meaB，优选来自大肠杆菌，Gene ID =12931931 ； 2)将步骤I)所得乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS克隆到质粒载体pACY-Duet上,构建重组质粒pACY-mvaE-mvaS ； 3)将步骤I)中所得的乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB克隆到质粒载体pCOLA-Duet上,构建重组质粒pCOLA-maeB-acs ； 4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到重组大肠杆菌。 本专利技术的另一目的在于提供一种利用所述基因工程菌生产甲羟戊酸的方法，该方法的步骤如下: I)获得乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE、HMG-CoA合酶基因mvaS、乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB ； 所述乙酰辅酶A合成酶基因acs,来自大肠杆菌，Gene ID:12933681 ;所述苹果酸酶基因meaB，来自大肠杆菌，Gene ID:12931931 ； 2)将步骤I)所得乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG-CoA还原酶基因mvaE和HMG-CoA合酶基因mvaS克隆到质粒载体pACY-Duet上,构建重组质粒pACY-mvaE-mvaS ； 3)将步骤I)中所得的乙酰辅酶A合成酶基因asc和苹果酸酶基因meaB克隆到质粒载体pCOLA-Duet上,构建重组质粒pCOLA-maeB-acs ； 4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到大肠杆菌BL21 (DE3)中，得到重组大肠杆菌； 5)将步骤4)所得的重组大肠杆菌按体积比1% -5%的接种量接种到乙酸培养基中发酵生产甲羟戊酸，发酵条件为:发酵温度为30-37°C、pH 6-8和培养至0D_为0.6-0.8，加入诱导剂IPTG至终浓度为0.1-1.0mmol.?Λ培养48小时。 所述应用中步骤5)所述乙酸培养基，每升含有6g乙酸、2g牛肉粉、Ig甜菜碱、KH2P042.5g、(NH4) 2S043g、柠檬酸-H2O lg, KCl 1.86g、FeS04_7H20 80mg、MgS04_7H20 0.24g,用NaOH将pH回调至7.0。 本专利技术所提供的基因工程菌，用于发酵生产以甲羟戊酸为中间产物的代谢产品。 进一步，本专利技术还提供了一种以甲羟戊酸为中间产物，生产目的产物的方法。是在高产甲羟戊酸的基础上，进一步利用甲羟戊酸发酵生产目的产物异戊二烯以及异戊二烯基单元合成的萜类化合物。 本专利技术有益效果: 1.本专利技术构建的大肠杆菌能够转化乙酸生成甲羟戊酸。 2.利用本专利技术方法以乙酸为碳源，甲羟戊酸的产量可达到lg/L以上，最高产率可达到35%，为理论产率的60%。 3.本专利技术不仅可以生产甲羟戊酸，本专利技术方法还可用于发酵生产以甲羟戊酸为中间产物的发酵产品。 【附图说明】 图lpCOLA-acs 质粒图谱。 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌，其特征在于，是共表达乙酰辅酶A合成酶基因asc、苹果酸酶基因meaB、乙酰乙酰辅酶A硫解酶/HMG‑CoA还原酶基因mvaE和HMG‑CoA合酶基因mvaS的基因工程菌。
【技术特征摘要】
1.一种以乙酸为原料合成甲羟戊酸的基因工程菌，其特征在于，是共表达乙酰辅酶八合成酶基因38(3、苹果酸酶基因1116518、乙酰乙酰辅酶八硫解酶八还原酶基因蕭油和1116-00^合酶基因蕭必的基因工程菌。2.权利要求1所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶八合成酶基因和苹果酸酶基因III册8，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。3.权利要求2所述基因工程菌，其特征在于，所述乙酰辅酶八合成酶基因％8，来自大肠杆菌，(^611610:12931931。4.一种权利要求1所述基因工程菌的构建方法，其特征在于，步骤如下: 1)获得乙酰乙酰辅酶八硫解酶八还原酶基因蕭油、八合酶基因蕭必、乙酰辅酶八合成酶基因￡180和苹果酸酶基因1116&8 ； 2)构建含有乙酰乙酰辅酶八硫解酶八还原酶基因蕭油和册(^-(?八合酶基因^88的重组质粒； 3)构建含有乙酰辅酶八合成酶基因￡180和苹果酸酶基因1116218的重组质粒； 4)将步骤2)和步骤3)所得的重组质粒导入到宿主菌中，获得基因工程菌。5.权利要求4所述方法，其特征在于，所述乙酰辅酶八合成酶基因和苹果酸酶基因腕池，来源于枯草芽孢杆菌、烟曲霉菌或大肠杆菌。6.权利要求4所述方法，其特征在于，所述乙酰辅酶八合成酶基因％8，来自大肠杆菌，6611610:12931931。7.权利要求4所述方法，其特征在于，具体步骤如下: 1)获得乙酰乙酰辅酶八硫解酶八还原酶基因蕭油、八合酶基因蕭必、乙酰辅酶八合成酶基因￡180和苹果酸酶基因1116&8 ； 所述乙酰辅酶八合成酶基因，来自大肠杆菌，66116 10:12933681 ；所述苹果酸酶基因 1116218，来自大肠杆菌，(^6116 10:12931931 ； 2)将步骤1)所得乙酰乙酰辅酶八硫解酶八还原酶基因蕭油和册(^-(?...
【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，徐鑫，谢萌，刘辉，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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