一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有1，3-丁二醇(1，3-BDO)通路的微生物，该1，3-丁二醇(1，3-BDO)通路具有至少一种编码以足够的量表达的1，3-BDO通路酶的外源性核酸，以生产1，3-BDO。该通路包括选自如下的酶：2-氨基-4-酮戊酸(AKP)硫解酶、AKP脱氢酶、2-氨基-4-羟基戊酸转氨酶、2-氨基-4-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)、2-氧代-4-羟基戊酸脱羧酶、3-羟基丁醛还原酶、AKP转氨酶、AKP氧化还原酶(脱氨基)、2，4-二氧代戊酸脱羧酶、3-氧代丁醛还原酶(酮还原)、3-氧代丁醛还原酶(醛还原)、4-羟基-2-丁酮还原酶、AKP脱羧酶、4-氨基丁-2-酮转氨酶、4-氨基丁-2-酮氧化还原酶(脱氨基)、4-氨基丁-2-酮氨-裂解酶、丁烯酮水合酶、AKP氨-裂解酶、乙酰丙烯酸脱羧酶、乙酰乙酰基-CoA还原酶(CoA-依赖的、醛形成)、乙酰乙酰基-CoA还原酶(CoA-依赖的、醇形成)、乙酰乙酰基-CoA还原酶(酮还原)、3-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)、3-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4-羟基丁酰-CoA脱水酶和巴豆酸酶。一种用于生产1，3-BDO的方法，该方法包括在多种条件下培养这类微生物达足够长的时间，以生产1，3-BDO。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】,3-丁二醇的生物的制作方法，3-丁二醇的生物相关串请说明 本申请要求2009年4月30日提交的申请号为61/174，473的美国临时申请的优先权，所述美国临时申请的全部内容以引用方式并入本文。
技术介绍
一般地，本专利技术涉及能够生产有机化合物的生物合成过程和生物。更具体地，本专利技术涉及可以生产化学商品1，3-丁二醇的非天然存在的生物。1，3-丁二醇(1，3-BD0)是通过乙炔的水合作用传统地产自乙炔的四碳二醇。所得的乙醛然后被转化成3-羟基丁醛，所述3-羟基丁醛随后被还原以形成1，3-BD0。在最近几年，乙炔已经被较便宜的乙烯取代来作为乙醛来源。1，3-BD0通常被用作用于食品调味剂的有机溶剂。它还被用作聚氨酯和聚酯树脂的共聚单体并被广泛用作降血糖药物。光学活性的1，3-BD0是对生物活性化合物和液晶体的合成有用的起始材料。1，3_ 丁二醇的基本商业用途是随后经脱水，以提供I，3-丁二烯(Ichikawa等人，J. of MolecularCatalysis A-Chemical, 256 :106-112(2006) ;Ichikawa 等人,J. of Molecular CatalysisA-Chemical ,231 181-189 (2005))，I，3- 丁二烯是一种用于制造合成橡胶(如轮胎)、乳胶和树脂的250亿Ib/年的石化产品。对用于乙炔或乙烯的基于石油的原料的依赖使得有必要开发基于可再生原料生产1，3_ 丁二醇和丁二烯的路径。因此，需要开发微生物以及用其生产1，3_BD0的方法。本专利技术满足这种需要并且还提供相关的优势。专利技术概沭在一些实施方式中，本专利技术针对一种非天然存在的微生物，该微生物包括具有1，3-丁二醇(1，3-BD0)通路的微生物，该1，3_丁二醇(1，3-BD0)通路具有至少一种编码以足够的量表达的1，3-BD0通路酶的外源性核酸，以生产1，3-BD0。该1，3-BD0通路包括选自如下的酶2_氨基-4-酮戊酸(AKP)硫解酶、AKP脱氢酶、2-氨基-4-羟基戊酸转氨酶、2-氨基-4-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)、2_氧代-4-羟基戊酸脱羧酶、3-羟基丁醛还原酶、AKP转氨酶、AKP氧化还原酶(脱氨基)、2，4-二氧代戊酸脱羧酶、3-氧代丁醛还原酶(酮还原)、3_氧代丁醛还原酶(醛还原)、4_羟基-2- 丁酮还原酶、AKP脱羧酶、4-氨基丁 -2-酮转氨酶、4-氨基丁 -2-酮氧化还原酶(脱氨基)、4_氨基丁 -2-酮氨-裂解酶、丁烯酮水合酶、AKP氨-裂解酶、乙酰丙烯酸脱羧酶、乙酰乙酰基-Cok还原酶(CoA-依赖的、醛形成)、乙酰乙酰基-Cok还原酶(CoA-依赖的、醇形成)、乙酰乙酰基-Cok还原酶(酮还原)、3_羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)、3_羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)、4_羟基丁酰-CoA脱水酶和巴豆酸酶。在一些实施方式中，本专利技术针对一种，3-BD0的方法,该方法包括在多种条件下培养这类非天然存在的微生物达足够长的时间，以生产1，3_BD0。附图说明图I示出从丙氨酸到1，3-BD0的通路。酶为如下A)AKP硫解酶、B) AKP转氨酶或AKP氧化还原酶(脱氨基)、C) 2，4-二氧代戊酸脱羧酶、D) 3-氧代丁醛还原酶(醛还原)、E)AKP脱羧酶、F) 4-氨基丁 -2-酮氨-裂解酶、G) 丁烯酮水合酶、H) 4-羟基，2- 丁酮还原酶、DAKP氨-裂解酶、J)乙酰丙烯酸脱羧酶、K) 4-氨基丁 -2-酮转氨酶或4-氨基丁 -2-酮氧化还原酶(脱氨基)、UAKP脱氢酶、M) 2-氨基-4-羟基戊酸转氨酶或2-氨基-4-羟基戊酸氧化还原酶(脱氨基)、N) 2-氧代-4-羟基 戊酸脱羧酶、0) 3-氧代丁醛还原酶(酮还原)以及P) 3-羟基丁醛还原酶。图2示出从乙酰乙酰基-CoA到I，3-丁二醇的通路。酶为如下A)乙酰乙酰基-CoA还原酶(CoA-依赖的、醛形成)、B) 3-氧代丁醛还原酶(酮还原)、C) 3-羟基丁醛还原酶、D)乙酰乙酰基-Cok还原酶(CoA-依赖的、醇形成)、E) 3-氧代丁醛还原酶(醛还原)、F) 4-羟基，2- 丁酮还原酶、G)乙酰乙酰基-CoA还原酶(酮还原)、H) 3-羟基丁酰-CoA还原酶(醛形成)以及I) 3-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)。图3示出从4-羟基丁酰-CoA到1，3_ 丁二醇的通路。酶为如下A)4_羟基丁酰-Cok脱水酶、B)巴豆酸酶、C) 3-羟基丁酰-Cok还原酶(醛形成)、D) 3-羟基丁醛还原酶以及E) 3-羟基丁酰-CoA还原酶(醇形成)。图4示出对3-羟丁基-CoA显示明显活性的醛脱氢酶。图5示出透析前后来自糖乙酸多丁醇梭菌(Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum)的 bid 对 3_ 轻基丁酸-CoA 的比活。图6示出当3-羟基丁醛作为底物加入以及在没有底物的对照样品中1，3_BD0的浓度。显示了醇脱氢酶的GI号。图7示出当3-羟基丁酰-CoA作为底物加入以及在没有底物的对照样品中1，3-BD0的浓度。显示了醇脱氢酶的GI号。同时受测的醛脱氢酶的GI号是163762382。专利技术详述本专利技术部分地针对非天然存在的微生物，该微生物表达编码催化1，3- 丁二醇(1，3-BD0)生产的酶的基因。本文披露的用于1，3_ 丁二醇的生产的通路基于三个前体(i)D-丙氨酸、(ii)乙酰乙酰基-CoA以及iii) 4-羟基丁酰-CoA。成功地设计这些通路需要确定一组适当的具有足够的活性和特异性的酶、将其相应的基因克隆成生产宿主、优化发酵条件以及对发酵之后的产品形成进行测定。丙氨酸到1，3_BD0的转化可以通过多个通路以约五个酶催化步骤实现，如图I所示。在所有通路的第一步骤(步骤A)，丙氨酸和乙酰-CoA通过2-氨基-4-酮戊酸硫解酶(一种高度选择性的酶)结合。该反应的产物2-氨基-4-氧代戊酸(AKP)然后可以被转氨基、还原、脱羧或脱氨，如图I所示。用于1，3-BD0的生产的进一步合成步骤在下文详细讨论。从这些通路的每个通路获得1，3-BD0的理论产率计算为约I. 09摩尔/摩尔消耗的葡萄糖。图2概述了用于从乙酰乙酰基-CoA生产I，3-BD0的多个路径。从乙酰乙酰基-CoA到1，3-BD0的这些通路的每个通路利用三个还原当量并提供每摩尔消耗的葡萄糖I摩尔1，3-BD0的理论产率。其他碳源物(如合成气)也可以用于生产乙酰乙酰基-CoA。葡萄糖气化以形成合成气将导致最大的理论产率，即每摩尔消耗的葡萄糖1.09摩尔1，3-BD0(假设从葡萄糖获得6摩尔CO和6摩尔H2)6C0+6H2 — I. 091 C4H10O2+!. 636 C02+0. 545H24-羟基丁酰-CoA是一 种重要的起始代谢产物，许多工业上有用的化合物，包括I，3-BD0可以由其制造，如图3所示。虽然4-羟基丁酰-CoA不是非常普遍的中心代谢产物，用于设计合成4-羟基丁酰-CoA的菌株的方法已被申请人于美国专利申请号2009/0075351中在先描述。假设葡萄糖作为碳水化合物原料，从4-羟基丁酰-CoA到1，3- 丁二醇的通路具有I. 09摩尔/摩尔产品产率的理论产率。本专利技术还部分地针对用于通过培养这本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·P·博加德，M·J·伯克，罗宾·E·奥斯特豪特，普里蒂·法克雅，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：
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