3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶变体以及使用方法技术

本申请涉及3‑羟基丁酰基‑CoA脱氢酶变体以及使用方法。本公开内容提供了硫解酶和3‑羟基丁酰基‑CoA脱氢酶的多肽变体，编码它们的核酸、包含所述核酸的载体，以及包含所述多肽变体和/或硫解酶、所述核酸和/或所述载体的细胞。本公开内容还提供了制造和使用它们的方法，包括培养细胞的方法，以及生产各种产物的方法，所述产品包括3‑羟基丁酰基‑CoA(3‑HB‑CoA)、3‑羟基丁醛(3‑HBal)、3‑羟基丁酸(3‑HB)、1,3‑丁二醇(1,3‑BDO)以及其酯和酰胺，以及从任何这些制成的产物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般地涉及被工程化以产生期望的产物的生物体、促进期望的产物的生产的工程化的酶，更具体地涉及产生期望的产物例如3-羟基丁醇-coa、3-羟基丁醛、1,3-丁二醇和相关产物以及由此衍生的产物的酶和细胞。

技术介绍

1、各种商品化学物质被用于制造商业用途的期望产物。许多商品化学物质来源于石油。这一的商品化学物质具有各种用途，包括用作溶剂、树脂、聚合物前体和专门化学物质。期望的商品化学物质包括4-碳分子，例如1,4-丁二醇和1,3-丁二醇，上游前体和下游产品。希望的是开发用于商品化学物质生产的方法，来提供对石油基产品的可再生的来源，并提供能量密集性和资本密集性更低的过程。

2、因而，需要便于期望的产品的生产的方法。本专利技术满足了这一需求，并且还提供了相关的优势。

技术实现思路

1、在某些方面，本公开内容提供了分离的核酸分子。在某些实施方式中，所述分离的核酸分子选自：(a)第一核酸分子，其编码参考多肽的第一变体，其中(i)所述参考多肽具有seq id no:2的氨基酸序列；(ii)所述第一变体包含相对于seq id no:2的一个或更多个氨基酸取代，和(iii)所述一个或更多个氨基酸取代选自表1；(b)第二核酸分子，其编码所述参考多肽的第二变体，其中所述第二变体(i)包含选自表1的相应变体的一个或更多个氨基酸取代；和(ii)具有与所述相应变体至少50％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的序列同一性；(c)第三核酸分子，其在高度严格杂交条件下与所述第一或第二核酸分子杂交，并且包含编码所述一个或更多个氨基酸取代的核酸序列；和(d)第四核酸分子，其与所述第一核酸分子、所述第二核酸分子或所述第三核酸分子互补；其中所述第一变体、所述第二变体、所述第三变体和所述第四变体不是天然发生的。

2、在某些实施方式中，所述分离的核酸分子编码变体3-羟基丁酰基-coa脱氢酶，相对于由seq id no:2的氨基酸序列组成的参考3-羟基丁酰基-coa脱氢酶，所述变体3-羟基丁酰基-coa脱氢酶在将乙酰乙酰基-coa转化成3-羟基丁酰基-coa的反应中具有利用nadh作为辅助因子的提高的能力。在某些实施方式中，与所述参考3-羟基丁酰基-coa脱氢酶相比，所述变体3-羟基丁酰基-coa脱氢酶使用nadh作为辅助因子的能力是至少1.2倍更高、3倍更高、5倍更高或1.2倍到10倍更高之间。在某些实施方式中，所述分离的核酸分子是所述第二核酸分子，所述第二变体具有与选自表1的相应的变体至少80％、90％或95％的序列同一性。

3、在某些方面，本公开内容提供了分离的多肽变体，例如，参考多肽的变体。在某些实施方式中，所述参考多肽具有seq id no:2的氨基酸序列，所述多肽变体选自表1并具有相对于seq id no:2的一个或更多个氨基酸取代。在某些实施方式中，所述多肽变体包含与seq id no:2或与选自表1的变体具有至少50％的同一性的序列；以及所述多肽变体包含相应于seq id no:2的选自c34、g35、p36、n37、s38和r40的一个或更多个位置的氨基酸取代。在某些实施方式中，(i)所述相应于c34的氨基酸被替换为a、d、e、h、i、l、m、s、t、v或y；(ii)所述相应于g35的氨基酸被替换为c、d、e、f、h、i、k、l、m、p、q、r、s、t、v或y；(iii)所述相应于p36的氨基酸被替换为s；(iv)所述相应于n37的氨基酸被替换为k；(v)所述相应于s38的氨基酸被替换为a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、q、t、v、w或y；(vi)所述相应于r40的氨基酸被替换为a、d、e、f、g、h、i、k、l、m n、p、q、s、t、v或y；或(vii)任意组合的(i)-(vi)的两个或更多个。在某些实施方式中，所述多肽变体包含与seq id no:2或与选自表1的变体具有至少50％同一性的序列；以及所述多肽变体包含相对于seq id no:2的1、2、3、4、5或更多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自：a103m、a107v、a156s、a158r、a193r、a204t、c20f、c34a、c34d、c34e、c34h、c34i、c34l、c34m、c34s、c34t、c34v、c34y、d104a、d104e、d104q、d106h、d129e、d236c、d236v、e215h、e215w、e42q、e46c、e46s、e78k、f55i、g241g、g35*、g35a、g35c、g35d、g35e、g35f、g35h、g35i、g35k、g35l、g35m、g35p、g35q、g35r、g35s、g35t、g35v、g35y、g90v、k209q、l160a、l160m、l167q、l213n、l243a、l243i、l243v、n112c、n112d、n112h、n37k、p207q、p36s、q144q、q47l、q47l、q48q、r40a、r40d、r40e、r40f、r40g、r40h、r40i、r40k、r40l、r40m、r40n、r40p、r40q、r40s、r40t、r40v、r40y、r41h、r98c、s115r、s38a、s38c、s38d、s38e、s38f、s38g、s38h、s38i、s38k、s38l、s38m、s38q、s38t、s38v、s38w、s38y、t114c、t155c、t173s、t205n、t205q、t92h、t92n、v203i和v31i。在某些实施方式中，所述多肽变体包含与seq idno:2或与选自表1的变体具有至少80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列。

4、在某些实施方式中，所述分离的多肽变体是第一参考多肽的变体，其中(a)所述第一参考多肽具有seq id no:2的氨基酸序列，(b)所述多肽变体包含相对于seq id no:2的一个或更多个氨基酸取代，(c)所述一个或更多个氨基酸取代选自表1，和(d)所述多肽变体具有与选自表1的相应变体至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。在某些实施方式中，所述多肽变体具有与选自表1的相应变体至少80％、90％或95％的序列同一性。在某些实施方式中，所述多肽变体进一步包含相对于所述相应的第一参考多肽在1到100个修饰的氨基酸位置中的保守性氨基酸替换，其中所述修饰的位置不同于第二参考多肽的所述一个或更多个氨基酸取代。

5、在某些实施方式中，本文公开的多肽变体具有一个或更多个额外的特征。在某些实施方式中，所述一个或更多个氨基酸取代包括选自表1的至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代。在某些实施方式中，所述多肽变体包含与所述第一参考多肽相比在2到300个未修饰氨基酸位置处的不修饰，其中所述未修饰位置选自表2中提及的2、3、4或5个氨基酸序列之间相同的那些位置。在某些实施方式中，所述多肽可以将乙酰乙酰基-coa转化成3-羟基丁酰基-coa。在某些实施本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种分离的核酸分子，选自：

2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码变体3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶，相对于由SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的参考3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶，所述变体3-羟基丁酰基-CoA脱氢酶在将乙酰乙酰基-CoA转化成3-羟基丁酰基-CoA的反应中具有提高的利用NADH作为辅助因子的能力。

3.权利要求2的分离的核酸分子，其中：

4.权利要求1的分离的核酸分子，其中(a)所述分离的核酸分子是所述第二核酸分子，和(b)所述第二变体具有与选自表1的所述相应变体至少80％、90％或95％的序列同一性。

5.一种参考多肽的分离的多肽变体，其中(a)所述参考多肽具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，和(b)所述多肽变体选自表1并具有相对于SEQ ID NO:2的一个或更多个氨基酸取代。

6.一种分离的多肽变体，其中(a)所述多肽变体包含与SEQ ID NO:2或与选自表1的变体具有至少50％的同一性的序列；和(b)所述多肽变体包含相应于SEQ ID NO:2的选自C34、G35、P36、N37、S38和R40的一个或更多个位置的氨基酸取代。

7.权利要求6的分离的多肽变体，其中(i)所述相应于C34的氨基酸被替换为A、D、E、H、I、L、M、S、T、V或Y；(ii)所述相应于G35的氨基酸被替换为C、D、E、F、H、I、K、L、M、P、Q、R、S、T、V或Y；(iii)所述相应于P36的氨基酸被替换为S；(iv)所述相应于N37的氨基酸被替换为K；(v)所述相应于S38的氨基酸被替换为A、C、D、E、F、G、H、I、K、L、M、Q、T、V、W或Y；(vi)所述相应于R40的氨基酸被替换为A、D、E、F、G、H、I、K、L、M、N、P、Q、S、T、V或Y；或(vii)任意组合的(i)-(vi)的两个或更多个。

8.一种分离的多肽变体，其中(a)所述多肽变体包含与SEQ ID NO:2或选自表1的变体具有至少50％的同一性的序列；和(b)所述多肽变体包含相对于SEQ ID NO:2的1、2、3、4、5个或更多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自：A103M、A107V、A156S、A158R、A193R、A204T、C20F、C34A、C34D、C34E、C34H、C34I、C34L、C34M、C34S、C34T、C34V、C34Y、D104A、D104E、D104Q、D106H、D129E、D236C、D236V、E215H、E215W、E42Q、E46C、E46S、E78K、F55I、G241G、G35*、G35A、G35C、G35D、G35E、G35F、G35H、G35I、G35K、G35L、G35M、G35P、G35Q、G35R、G35S、G35T、G35V、G35Y、G90V、K209Q、L160A、L160M、L167Q、L213N、L243A、L243I、L243V、N112C、N112D、N112H、N37K、P207Q、P36S、Q144Q、Q47L、Q47L、Q48Q、R40A、R40D、R40E、R40F、R40G、R40H、R40I、R40K、R40L、R40M、R40N、R40P、R40Q、R40S、R40T、R40V、R40Y、R41H、R98C、S115R、S38A、S38C、S38D、S38E、S38F、S38G、S38H、S38I、S38K、S38L、S38M、S38Q、S38T、S38V、S38W、S38Y、T114C、T155C、T173S、T205N、T205Q、T92H、T92N、V203I和V31I。

9.权利要求5-8的任一项的分离的多肽变体，其中所述多肽变体包含与SEQ ID NO:2或选自表1的变体具有至少80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列。

10.一种第一参考多肽的分离的多肽变体，其中(a)所述第一参考多肽具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列，(b)所述多肽变体包含相对于SEQ ID NO:2的一个或更多个氨基酸取代，(c)所述一个或更多个氨基酸取代选自表1，和(d)所述多肽变体具有与选自表1的相应变体至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。

11.权利要求10的分离的多肽变体，其中：

12.权利要求5-11的任一项的分离的多肽变体，其中：

13.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求5-12的任一项的分离的多肽的序列。

14.一种载体，其含有权利要求1-4或13的任一项的核酸分子。

15.一种细胞，其...

【技术特征摘要】

1.一种分离的核酸分子，选自：

2.权利要求1的分离的核酸分子，其中所述分离的核酸分子编码变体3-羟基丁酰基-coa脱氢酶，相对于由seq id no:2的氨基酸序列组成的参考3-羟基丁酰基-coa脱氢酶，所述变体3-羟基丁酰基-coa脱氢酶在将乙酰乙酰基-coa转化成3-羟基丁酰基-coa的反应中具有提高的利用nadh作为辅助因子的能力。

3.权利要求2的分离的核酸分子，其中：

4.权利要求1的分离的核酸分子，其中(a)所述分离的核酸分子是所述第二核酸分子，和(b)所述第二变体具有与选自表1的所述相应变体至少80％、90％或95％的序列同一性。

5.一种参考多肽的分离的多肽变体，其中(a)所述参考多肽具有seq id no:2的氨基酸序列，和(b)所述多肽变体选自表1并具有相对于seq id no:2的一个或更多个氨基酸取代。

6.一种分离的多肽变体，其中(a)所述多肽变体包含与seq id no:2或与选自表1的变体具有至少50％的同一性的序列；和(b)所述多肽变体包含相应于seq id no:2的选自c34、g35、p36、n37、s38和r40的一个或更多个位置的氨基酸取代。

7.权利要求6的分离的多肽变体，其中(i)所述相应于c34的氨基酸被替换为a、d、e、h、i、l、m、s、t、v或y；(ii)所述相应于g35的氨基酸被替换为c、d、e、f、h、i、k、l、m、p、q、r、s、t、v或y；(iii)所述相应于p36的氨基酸被替换为s；(iv)所述相应于n37的氨基酸被替换为k；(v)所述相应于s38的氨基酸被替换为a、c、d、e、f、g、h、i、k、l、m、q、t、v、w或y；(vi)所述相应于r40的氨基酸被替换为a、d、e、f、g、h、i、k、l、m、n、p、q、s、t、v或y；或(vii)任意组合的(i)-(vi)的两个或更多个。

8.一种分离的多肽变体，其中(a)所述多肽变体包含与seq id no:2或选自表1的变体具有至少50％的同一性的序列；和(b)所述多肽变体包含相对于seq id no:2的1、2、3、4、5个或更多个氨基酸取代，所述氨基酸取代选自：a103m、a107v、a156s、a158r、a193r、a204t、c20f、c34a、c34d、c34e、c34h、c34i、c34l、c34m、c34s、c34t、c34v、c34y、d104a、d104e、d104q、d106h、d129e、d236c、d236v、e215h、e215w、e42q、e46c、e46s、e78k、f55i、g241g、g35*、g35a、g35c、g35d、g35e、g35f、g35h、g35i、g35k、g35l、g35m、g35p、g35q、g35r、g35s、g35t、g35v、g35y、g90v、k209q、l160a、l160m、l167q、l213n、l243a、l243i、l243v、n112c、n112d、n112h、n37k、p207q、p36s、q144q、q47l、q47l、q48q、r40a、r40d、r40e、r40f、r40g、r40h、r40i、r40k、r40l、r40m、r40n、r40p、r40q、r40s、r40t、r40v、r40y、r41h、r98c、s115r、s38a、s38c、s38d、s38e、s38f、s38g、s38h、s38i、s38k、s38l、s38m、s38q、s38t、s38v、s38w、s38y、t114c、t155c、t173s、t205n、t205q、t92h、t92n、v203i和v31i。

9.权利要求5-8的任一项的分离的多肽变体，其中所述多肽变体包含与seq id no:2或选自表1的变体具有至少80％、90％、95％或99％的序列同一性的序列。

10.一种第一参考多肽的分离的多肽变体，其中(a)所述第一参考多肽具有seq id no:2的氨基酸序列，(b)所述多肽变体包含相对于seq id no:2的一个或更多个氨基酸取代，(c)所述一个或更多个氨基酸取代选自表1，和(d)所述多肽变体具有与选自表1的相应变体至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性。

11.权利要求10的分离的多肽变体，其中：

12.权利要求5-11的任一项的分离的多肽变体，其中：

13.一种分离的核酸分子，其包含编码根据权利要求5-12的任一项的分离的多肽的序列。

14.一种载体，其含有权利要求1-4或...

【专利技术属性】
技术研发人员：凯文·霍夫，卡拉·安·特蕾西韦尔，陈奎，迈克尔·库钦斯卡斯，H·纳卡拉占，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：