【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本公开大体上涉及甲酸脱氢酶(fdh)变体和使用此类变体的方法，更具体地涉及由重组核酸编码的甲酸脱氢酶变体，所述重组核酸已被引入非天然存在的微生物生物体中以增强nadh的生产，从而增加生物衍生化合物(例如1,3-丁二醇)的生产。
技术介绍
1、1,3-丁二醇(1,3-bdo；也称为1,3-丁二醇、1,3-bg、丁二醇、bg)是传统上由乙炔通过其水合产生的四个碳的二醇。所得乙醛而后被转化为3-羟基丁醛，其随后被还原以形成1,3-bdo。最近，乙炔已被更便宜的乙烯取代，以作为乙醛的来源。1,3-bdo通常用作食品调味剂的有机溶剂。它还用作聚氨酯和聚酯树脂的共聚单体，并被广泛用作降血糖剂。光学活性1,3-bdo是可用于合成生物活性化合物和液晶的起始材料。1,3-bdo的另一个用途是其经脱水提供1,3-丁二烯(ichikawa等人，journal of molecular catalysis a-chemical256:106-112(2006)；ichikawa等人，journal of molecular catalysis a-chemical 231:181-189(2005))，其可用于制造合成橡胶(例如轮胎)、乳胶和树脂。乙炔或乙烯对石油基原料的依赖保证了对基于可再生原料生产1,3-bdo和丁二烯的路线的开发。
2、1,4-丁二醇(1,4-bdo)是生产高性能聚合物、溶剂和精细化学品的有价值的化学品。它是生产其他高价值化学品如四氢呋喃(thf)和γ-丁内酯(gbl)的基础。价值链由三个主要部分构成，包括：(1)聚合
3、1,4-bdo由两条主要的石化路线生产，还有几条额外路线也在商业运营中。一条路线包括使乙炔与甲醛反应，然后进行氢化。最近，引入了1,4-bdo工艺，其包括丁烷或丁二烯氧化成马来酸酐，然后进行氢化。1,4-bdo几乎完全用作合成其他化学品和聚合物的中间体。
4、每年生产超过250亿磅丁二烯(1,3-丁二烯，bd)，用于制造聚合物，如合成橡胶和abs树脂，以及化学品，如己二胺和1,4-丁二醇。例如，丁二烯可以与许多其他化学品如其他烯烃(例如苯乙烯)反应以制造多种共聚物(例如丙烯腈1,3-丁二烯苯乙烯(abs)、苯乙烯-1,3-丁二烯(sbr)橡胶、苯乙烯-1,3-丁二烯乳胶)。这些材料用于橡胶、塑料、绝缘材料、玻璃纤维、管道、汽车和船舶零件、食品容器和地毯背衬。丁二烯通常作为蒸汽裂化过程的副产品生产，用于将石油原料如石脑油、液化石油气、乙烷或天然气转化为乙烯和其他烯烃。从替代和/或可再生原料制造丁二烯的能力将代表寻求更可持续的化学生产工艺的重大进步。
5、巴豆醇，也称为2-丁烯-1-醇，是一种有价值的化学中间体。它是巴豆基卤化物、酯和醚的前体，而这些物质又是单体、精细化学品、农用化学品和药品生产中的化学中间体。示例性精细化学品包括山梨酸、三甲基氢醌、巴豆酸和3-甲氧基丁醇。巴豆醇也是1,3-丁二烯的前体。巴豆醇目前完全由石油原料生产。例如，日本专利47-013009和美国专利第3,090,815、3,090,816和3,542,883号描述了一种通过1,2-环氧丁烷的异构化生产巴豆醇的方法。从替代和/或可再生原料制造巴豆醇的能力将代表寻求更可持续的化学生产工艺的重大进步。
6、3-丁烯-2-醇(也称为甲基乙烯基甲醇(mvc))是一种可用于生产丁二烯的中间体。与1,3-bdo相比，使用3-丁烯-2-醇具有显著优势，因为分离步骤更少，并且只有一个脱水步骤。3-丁烯-2-醇还可用作溶剂、用于聚合物生产的单体、或精细化学品的前体。因此，从替代和/或可再生原料制造3-丁烯-2-醇的能力将再次为可持续化学生产工艺带来显著优势。
7、己二酸是一种二羧酸，分子量为146.14。它可用于生产尼龙6,6，一种由己二酸与己二胺缩合而成的线性聚酰胺。这用于制造不同种类的纤维。己二酸的其他用途包括用于增塑剂、不饱和聚酯和聚酯多元醇。其他用途包括生产聚氨酯、润滑剂成分，以及作为调味剂和胶凝助剂以用作食品成分。
8、历史上，己二酸是通过氧化由多种脂肪制备的。目前的一些己二酸合成工艺依赖于使用过量的强硝酸对ka油(环己酮(酮或k组分)和环己醇(醇或a组分)的混合物)或纯环己醇进行氧化。该主题有数种变化，它们在ka或环己醇的生产路线上有所不同。例如，苯酚是ka油生产中的替代原料，并且已经描述了由苯酚合成己二酸的工艺。该工艺的其他版本倾向于使用硝酸以外的氧化剂，例如过氧化氢、空气或氧气。
9、除了如上所述的己二胺(hmda)用于生产尼龙-6,6外，它还用于制备六亚甲基二异氰酸酯，这是一种用于生产聚氨酯的单体原料。二胺还用作环氧树脂中的交联剂。hmda目前通过己二腈的氢化产生。
10、己内酰胺是一种有机化合物，是6-氨基己酸(ε-氨基己酸、6-氨基己酸)的内酰胺。它也可以被认为是己酸的环酰胺。己内酰胺的一个用途是作为生产尼龙-6的单体。己内酰胺可以通过使用硫酸羟铵的肟化工艺，然后使用贝克曼重排工艺步骤进行催化重排从环己酮合成。
11、甲基丙烯酸(maa)是甲基丙烯酸甲酯(mma)的关键前体，甲基丙烯酸甲酯是一种化学中间体，全球需求量每年超过45亿磅，其中大部分被转化为聚丙烯酸酯。合成甲基丙烯酸甲酯的常规工艺(即丙酮氰醇路线)包括将氰化氢(hcn)和丙酮转化为丙酮氰醇，然后进行酸辅助水解和与甲醇的酯化以得到maa。处理潜在致命的hcn的困难以及副产品处理的高成本(每吨maa形成1.2吨硫酸氢铵)引发了大量旨在实现更清洁和更经济的工艺的研究。作为起始材料，maa可以容易地通过与甲醇酯化转化为mma。
12、微生物生物体可用于生产生物衍生化合物，如1,3-bdo、1,4-bdo、丁二烯、巴豆醇、mvc、己二酸酯/盐、hmda、己内酰胺和maa。此种生产的滴度、速率和产率可受辅因子可用性限制。特别是，有限的辅因子，例如还原剂还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nadh)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nadph)，可导致受限的氧化还原可用性。例如，nadph为生物合成反应提供了还原当量，如脂质和核酸合成，以及涉及防止活性氧类(ros)毒性的氧化还本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种工程化甲酸脱氢酶，其包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的变体或其功能片段，其中所述工程化甲酸脱氢酶包含在表6和/或表7中所述的位置处的一个或更多个改变。
2.根据权利要求1所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶能够：
3.根据权利要求1或2所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶能够催化甲酸转化为二氧化碳和催化NAD+转化为NADH。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶包含比由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的氨基酸序列组成的甲酸脱氢酶的活性高至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍或至少2倍的活性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置2、9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、100、101、120、121、122、123、124、128、138、143、144、145、146、147、149、150、151、152、153
6.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置2、9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、101、120、122、124、138、144、145、146、147、150、151、155、175、176、191、198、199、204、206、217、218、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、319、325、329、335、336、338、339、342、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置2、98、199、206、231、266或381或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:1中位置9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、101、120、122、124、138、144、145、146、147、150、151、155、175、176、191、198、199、204、217、218、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、319、325、329、335、336、338、339、342、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:2中位置36、64、80、91、97、111、120、162、164、187、188、214、229、256、257、260、312、313、315、320、323、361或362或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于SEQ ID NO:2中位置36、64、80、111、120、162、214、229、260、315、320或361或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变为保守性氨基酸取代。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变为非保守性氨基酸取代。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶的一个或更多个氨基酸改变是表6...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种工程化甲酸脱氢酶，其包含氨基酸序列seq id no:1或seq id no:2的变体或其功能片段，其中所述工程化甲酸脱氢酶包含在表6和/或表7中所述的位置处的一个或更多个改变。
2.根据权利要求1所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶能够：
3.根据权利要求1或2所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶能够催化甲酸转化为二氧化碳和催化nad+转化为nadh。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶包含比由seq id no:1或seq id no:2的氨基酸序列组成的甲酸脱氢酶的活性高至少0.5倍、至少1倍、至少1.5倍或至少2倍的活性。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于seq id no:1中位置2、9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、100、101、120、121、122、123、124、128、138、143、144、145、146、147、149、150、151、152、153、155、175、176、191、196、198、199、203、204、206、217、218、224、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、315、319、325、329、335、336、338、339、342、343、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于seq id no:1中位置2、9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、101、120、122、124、138、144、145、146、147、150、151、155、175、176、191、198、199、204、206、217、218、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、319、325、329、335、336、338、339、342、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
7.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于seq id no:1中位置2、98、199、206、231、266或381或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
8.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于seq id no:1中位置9、16、19、27、29、30、41、53、73、97、98、101、120、122、124、138、144、145、146、147、150、151、155、175、176、191、198、199、204、217、218、231、238、256、262、264、265、266、267、269、271、284、285、287、290、291、297、301、303、313、319、325、329、335、336、338、339、342、346、350、355、365、374、381、382或384或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
9.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于seq id no:2中位置36、64、80、91、97、111、120、162、164、187、188、214、229、256、257、260、312、313、315、320、323、361或362或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
10.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶在对应于seq id no:2中位置36、64、80、111、120、162、214、229、260、315、320或361或其组合的位置处包含一个或更多个氨基酸取代。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变为保守性氨基酸取代。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变为非保守性氨基酸取代。
13.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶的一个或更多个氨基酸改变是表6中所述的改变。
14.根据权利要求13所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶：
15.根据权利要求13所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶：
16.根据权利要求13所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶：
17.根据权利要求13所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶：
18.根据权利要求13所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶：
19.根据权利要求1至4中任一项所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述工程化甲酸脱氢酶的一个或更多个氨基酸改变是表7中所述的改变。
20.根据权利要求19所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶：
21.根据权利要求19所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶：
22.根据权利要求19所述的工程化甲酸脱氢酶，其中所述一个或更多个氨基酸改变产生包含以下的工程化甲酸脱氢酶：
23.根据权利要求19所述的工程化甲酸...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·M·沙赫，J·R·科尔奎特，钟萌梦，N·施密特，林佳忠，J·R·瓦尔纳，
申请(专利权)人：基因组股份公司，
类型：发明
国别省市：
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