【技术实现步骤摘要】
本申请涉及核酸检测，具体涉及基于rpa-crispr/cas13a的猴痘病毒核酸检测方法。
技术介绍
1、mpxv作为一种人畜共患dna病毒，于1970年首次在人体中发现。其传播途径与天花病毒类似，可通过受感染动物咬伤、呼吸道飞沫、皮肤损伤部位密切或直接接触等方式传播。受感染人群往往会出现发烧、头痛、肌肉酸痛、背痛、淋巴结肿大和皮疹等多种症状。大多数轻症患者会在数周内康复，少数重症患者可导致死亡。当前mpxv的检测方法主要包括qpcr、elisa等。然而，上述检测方法均需借助复杂昂贵的仪器设备和熟练的技术操作人员，且往往耗时较长，仅适合在实验室环境下开展。因此，亟待开发简易、快速、高灵敏的mpxv检测新方法。
2、近年来发展的规律间断成簇短回文重复序列 (clustered regularlyinterspaced short palindromic repeats, crispr)技术因其卓越的检测机制、快速的反应效率、优异的检测灵敏度、简易的外部反应条件而被广泛的应用于现场即时检测(point-of-care testing, poct)。常用的crispr检测系统主要包括cas9、cas12和cas13。其中，cas12和cas13因具有独特的反式切割特性而被广泛研究与应用。具体地，通过cas12或cas13蛋白结合人工体外合成的crrna，当识别到目标dna或者rna序列时，可激活cas蛋白的反式切割特性，非特异的切割反应体系中的dna或者rna分子，通过对这些dna或者rna分子做标记修饰，从而实现对于靶标
技术实现思路
1、本申请要解决的技术问题是：如何快速准确的检测或鉴定猴痘病毒。
2、为解决上述技术问题，本申请提供一种检测猴痘病毒的方法，所述方法包括如下步骤：
3、s1）将待测样本与病毒裂解试剂混合获得裂解样本（含有待测样本的核酸）；
4、s2）将裂解样本与rpa-crispr/cas13a检测组合物混合获得rpa-crispr/cas13a检测体系，孵育后进行检测，根据检测结果确定待测样本是否含有猴痘病毒；
5、所述rpa-crispr/cas13a检测组合物是包括核酸组合物的物质，所述核酸组合物由特异扩增猴痘病毒特异dna片段的引物对和crrna组成，所述引物对由rpa上游引物和rpa下游引物组成，所述rpa上游引物为核苷酸序列是seq id no.1的单链dna分子；所述rpa下游引物为核苷酸序列是seq id no.2的单链dna分子；所述crrna包括靶向猴痘病毒基因的靶向区段，所述靶向区段的核苷酸序列是seq id no.3第37-64位。
6、seq id no.1第1-24位为t7 启动子序列，用于特异性结合rna聚合酶；第25-54位为扩增猴痘病毒的特异性性f3l基因片段的上游引物序列，用于特异性扩增猴痘病毒特异dna片段。
7、进一步地，所述crrna还包含与cas13a蛋白结合的结构序列（scaffoldsequence），所述结构序列的核苷酸序列为seq id no.3第1-36位。
8、本申请中，所述crrna可由体外转录制备或化学合成。
9、进一步地，所述crrna的核苷酸序列为seq id no.3。
10、进一步地，所述的方法中，所述rpa-crispr/cas13a检测组合物还包括lwacas13a蛋白。
11、在本申请的一些实施方式中，所述lwacas13a蛋白为吐露港公司产品，货号为32117-01。
12、进一步地，所述的方法中，所述rpa-crispr/cas13a检测组合物还包括报告rna。
13、进一步地，所述报告rna为具有信号报告功能的rna分子，当所述rna分子被降解时，能够报告阳性信号并被检测到。
14、所述报告rna为一端连接有荧光基团另一端连接有淬灭基团的单链rna。所述荧光基团选自fam、6-fam、vic、hex、trt、cy3、cy5、rox、joe、fitc、tet、ned、tamra、lc red640、lcred705、quasar705或texas red中的至少一种。所述淬灭基团可选自tamra、bhq1、bhq2、bhq3、mgb、dabcy1中的至少一种。
15、在本申请的一些实施方式中，所述报告rna的结构如下：
16、5’-fam-uuuuu-bhq1-3’。
17、其中fam为荧光基团，bhq1为荧光淬灭基团，uuuuu为核苷酸序列。
18、进一步地，所述的方法中，所述rpa-crispr/cas13a检测组合物还包括用于rpa（recombinase polymerase amplification，重组酶聚合酶扩增）试剂。
19、本申请，所述rpa试剂为twistdxtm的产品，货号为tabas03kit。所述rpa试剂含rpa冻干粉、rpa重悬液与醋酸镁。
20、使用时，将dna模板、对应的扩增引物对和rpa试剂混合即可实现rpa反应。
21、进一步地，所述的方法中，所述rpa-crispr/cas13a检测组合物还包括用于dna体外转录的组分。
22、进一步地，所述用于dna体外转录的组分包括t7 rna聚合酶、核糖核酸酶h、rna酶抑制剂和 rntp混合液。
23、在本申请的一些实施方式中，所述rpa-crispr/cas13a检测组合物包括：lwacas13a蛋白，crrna，t7 rna聚合酶，核糖核酸酶h，rna酶抑制剂，rntp混合液，报告rna（即荧光淬灭探针），rpa上游引物，rpa下游引物，rpa试剂（包括rpa冻干粉、rpa重悬液和醋酸镁）；
24、在本申请的一些实施方式中，将rpa-crispr/cas13a检测组合物中的rpa重悬液与醋酸镁按照混合获得缓冲液，使缓冲液中醋酸镁的浓度为5-50 mm。将裂解样本、缓冲液和rpa-crispr/cas13a检测组合物中其他组分（除rpa重悬液和醋酸镁以外的其他组分）混合获得rpa-crispr/cas13a检测体系，孵育后进行检测。
25、本申请所述的rpa-crispr/cas13a检测体系中，所述lwacas13a蛋白的使用浓度可为25-200 nm。在本申请一些实施方式中，所述lwacas13a蛋白的使用浓度为50 nm。
26、本申请所述的rpa-crispr/c本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测猴痘病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括LwaCas13a蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括报告RNA。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括用于RPA反应的组分。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物还包括用于DNA体外转录的组分。
6.权利要求1-5中任一项所述的核酸组合物。
7.用于检测猴痘病毒的组合物，其特征在于，所述组合物为权利要求1-5中任一项所述的RPA-CRISPR/Cas13a检测组合物。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包括权利要求1中所述的病毒裂解试剂。
9.用于检测猴痘病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求8或9所述的组合物。
10.应用，其特征在于，所述应用为权利要求7或8所述的组合物在下述任一项中的应用和/或权利要求9所述的试剂盒在B1）、B3）、B5）、B7）B9）和B11）任一项中的应用：
...【技术特征摘要】
1.一种检测猴痘病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述rpa-crispr/cas13a检测组合物还包括lwacas13a蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述rpa-crispr/cas13a检测组合物还包括报告rna。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述rpa-crispr/cas13a检测组合物还包括用于rpa反应的组分。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述rpa-crispr/cas13a检测组合物还包括用于dna体外转录的组分。...
【专利技术属性】
技术研发人员：王升启，荣振，王运祥，韩勇军，陈红，魏红娟，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事科学院军事医学研究院，
类型：发明
国别省市：
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