【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物工程，尤其涉及一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法。
技术介绍
1、d-阿洛酮糖（d-psicose）是自然界中含量极少的一种六碳糖，d-阿洛酮糖是一种低能量、不消化的食糖替代品，其具有降低血糖的功效，目前被国外许多制药企业当做甜味添加剂使用。此外，因d-阿洛酮糖可以通过美拉德反应使得食物具有较好的持水性，在食品领域用处广泛。d-阿洛酮糖还具有（1）降低血糖，作为ⅱ型糖尿病人的辅助治疗剂、膳食补充剂和甜味剂；（2）降低血脂，减少脂肪合成酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积；（3）抗氧化活性，具有很强的活性氧（ros）清除能力及谷胱甘肽还原能力；（4）神经保和抗炎作用等。
2、d-阿洛酮糖是果糖的c-3位置的差向异构体，而d-阿洛酮糖-3-差向异构酶(d-allulose -3-epimerase，daease)是一类能将果糖进行三号位碳差向异构化生产d-阿洛酮糖的固定化酶，目前大约有20多种daease。现有技术中，生产d-阿洛酮糖的研究热点是采用固定化酶，此方法有反应速度快、转化率稳定、副产物少、成本低廉等优点。现有的固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、交联法和共价结合法。
3、吸附法是最早出现的固定化方法，吸附法又可以分为两种，分别是离子交换吸附和物理吸附。吸附法条件比较温和，不会很大程度地改变酶的构象，因此对酶的催化性能不会产生大的影响；但是酶和载体之间的结合力较弱，在一些特殊的条件下，比如高盐浓度、高温等条件下，酶就很容易从载体上脱落并且污染催化反应产物。
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5、交联法指的是利用一些多功能交联试剂，如戊二醛等，在酶分子间或酶分子和载体分子间形成共价键，在不同的交联条件下，生产固定化酶。但是由于交联反应的无序性，可能在酶的活性中心发生交联而使酶活降低或失活。所以单一酶固定方式都有一定的缺陷。
6、共价结合法有稳固的共价键结合，使得酶不易从载体上脱落，可重复使用多次，但是易产生毒废料且化学试剂结合易使部分酶失活。
7、公开号为cn 110438113 的专利中公开了一种d-阿洛酮糖3-差向异构酶的固定化方法，其只使用包埋法，虽然说能够提高转化率，但是并没有公开转化率的数据，且55℃最多使用18批次，按照每批次使用时长4h计算，则最多使用72h，相当于3天，使用时间较短。
技术实现思路
1、有鉴于此，本专利技术提出了一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，该固定方法采用包埋法与交联法相结合的方式固定差向异构酶，简单高效，经济实用；并且采用该方法制备的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶，d-阿洛酮糖的转化率能够达到30%，并且可以连续反应30天以上。
2、本专利技术的技术方案是这样实现的：
3、一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，包括如下步骤：
4、步骤一 将树脂先用蒸馏水浸泡胀润，去掉表面杂质，然后用碱性溶液和酸性溶液交替洗涤，再用蒸馏水洗涤至ph7-8，最后用两倍树脂体积的蒸馏水浸泡3.5-4.5h，浸泡完全后在4℃冰箱保存备用，得到预处理树脂。
5、步骤二 使用ph为8的pbs缓冲液配制浓度为5000-10000u/l的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液。向酶液中加入mn2+，使mn2+的质量浓度到0.8-1.3g/l，在4℃冰箱保存备用；得到预处理酶液；
6、固定方法中，向酶液中加入mn2+，能够稳定d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的活性，使固定化细胞具有较高的活性和稳定性，从而提高d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的吸收率和d-阿洛酮糖的转化率。本专利技术的mn2+，可以选用mncl2。
7、步骤三 向上述预处理树脂中添加上述预处理酶液，在25-40℃、搅拌转速为100-300r/min的条件下吸附2-8h，吸附完成后，得到d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的溶液。
8、步骤四 向上述溶液中加入体积分数为5-10%的交联剂，在30-40℃、搅拌转速为150-300r/min的条件下交联2-8h，交联完成后，得到d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂。
9、本专利技术以树脂作为固定化酶的载体，随后加入交联剂，采用树脂材料与交联剂，先吸附再交联的方式固定化过程，以包埋-交联法固定，得到d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂。
10、本专利技术中，树脂为离子交换树脂或大孔吸附树脂；离子交换树脂为弱碱性阴离子交换树脂；阴离子交换树脂的型号可以为zga313、zgd630、d319、zga304、zga412、zga302、d213、zga351、lx-703ss中的一种。优选的，树脂为弱碱性阴离子交换树脂zga351，该树脂在大孔结构的苯乙烯——二乙烯苯共聚体上带有季铵基[—n(ch3)3oh]，与酶的官能团相结合后，固定的更加稳定，因此，其吸附效果相较于其他型号的树脂更好。
11、步骤三的吸附过程中，预处理酶液和预处理树脂的质量比为（5-10）：1，单位为g。
12、本专利技术中，交联剂选用双醛淀粉、聚乙二醇、二缩水甘油醚、戊二醛、京尼平、新戊二醇二缩水甘油醚中的一种。优选的，交联剂选用戊二醛。
13、优选的，吸附前后与加交联剂前后需使用bradford试剂盒测溶液中蛋白浓度变化，蛋白减少量越大说明固定化效果越好。
14、优选的，步骤一中，交替洗涤为：采用质量浓度为3-5％的naoh溶液和质量浓度为3-5％的hcl溶液进行交替清洗，共清洗3次，每次3-5h。
15、优选的，步骤二中，预处理酶液中d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的质量浓度为1-5g/l。
16、本专利技术的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法相对于现有技术具有以下有益效果：
17、1、采用包埋法与交联法相结合的方式固定差向异构酶，提高d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的吸附效果和连续运行时间。
18、2、树脂的型号为zga351、交联剂选用戊二醛，通过两种原料的选择，进一步提高d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的吸附效果和d-阿洛酮糖的转化率，保证连续运行时间。
19、3、在d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶液中添加了mn2+，吸附过程中保持温度为25-40℃，通过上述反应条件和参数的控制，再进一步提高d-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶制剂的吸附效果和d-阿洛酮糖的转化率，固定化酶制剂可以连续运行30天以上，并且30天内转化率稳定保持在30%以上。
20、4、由于转化率高，在工业化生产d-阿洛酮糖的过程中能够反复回收利用，极大的降低了成本，更本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤二中，向酶液中加入Mn2+后，使Mn2+的质量浓度到0.8-1.3g/L。
3.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤二中，预处理酶液中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的质量浓度为1-5g/L。
4.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤三的吸附过程中，在25-40℃、搅拌转速为100-300r/min条件下进行吸附，吸附时间为2-8h。
5.如权利要求4所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤三的吸附过程中，预处理酶液和预处理树脂的质量比为（5-10）：1。
6.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤一中，交替洗涤为：采用质量浓度为3-5％的NaOH溶液
...【技术特征摘要】
1.一种d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤二中，向酶液中加入mn2+后，使mn2+的质量浓度到0.8-1.3g/l。
3.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定化酶制剂的固定方法，其特征在于：所述步骤二中，预处理酶液中d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的质量浓度为1-5g/l。
4.如权利要求1所述的d-阿洛酮糖-3-差向异构酶固定...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭传庄，张志伟，王建彬，李小双，李丕武，孙瑞成，汪俊卿，王婷，
申请(专利权)人：东晓生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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