【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物，具体涉及一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病的试剂盒及其应用。
技术介绍
1、ahpnd严重影响了对虾产业的发展。鉴于该病的危害严重，目前世界动物卫生组织(oie)已将其列入水生动物疫病法定报告目录。对虾急性肝胰腺坏死病(acutehepatopancreatic necrosis disease，ahpnd)，又称早期死亡综合征(early mortalitysyndrome，ems)，是一种致命性的细菌性疾病，主要危害斑节对虾(penaeusmonodon)、凡纳滨对虾(litopenaeusvannamei)。
2、ahpnd病原诊断的方法主要是组织病理观察和pcr诊断方法，组织病理观察诊断法具有方便、快速、简单等优点，但是对工作人员的实践经验要求较高；pcr诊断是近年来的流行的检测手段，如普通pcr和qpcr等方法有灵敏度高、特异性强、通量高的优势，但需要在实验室内依靠专业的技术人员和实验仪器才能实现检测。目前仍需要开发快速、便捷的ahpnd检测方法，以用于现场的快速检测。
技术实现思路
1、本专利技术旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本专利技术提出一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病pirvpa基因的crrna。
2、本专利技术还提出一种等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病pirvpa基因的rpa引物对。
3、本专利技术还提出一种用于对虾急性肝胰腺坏死病快速检测的crispr/cas12a检测体系。
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5、本专利技术还提出上述crrna、rpa引物对、crispr/cas12a检测体系和试剂盒的应用。
6、根据本专利技术的第一方面，提出了一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病pirvpa基因的crrna，所述crrna包括crrna2、crrna3、crrna4和crrna5中的至少一种；所述crrna2的引物序列如seq id no:1、seq id no:2所示；所述crrna3的引物序列如seq id no:3、seq idno:4所示；所述crrna4的引物序列如seq id no:5、seq id no:6所示；所述crrna5的引物序列如seq id no:7、seq id no:8所示。
7、根据本专利技术的第二方面，提出了等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病pirvpa基因的rpa引物对；所述rpa引物对的序列选自以下(1)～(5)中的至少一种：
8、(1)序列如seq id no:9所示的正向引物，序列如seq id no:10所示的反向引物；
9、(2)序列如seq id no:11所示的正向引物，序列如seq id no:12所示的反向引物；
10、(3)序列如seq id no:13所示的正向引物，序列如seq id no:14所示的反向引物；
11、(4)序列如seq id no:15所示的正向引物，序列如seq id no:16所示的反向引物；
12、(5)序列如seq id no:17所示的正向引物，序列如seq id no:18所示的反向引物。
13、根据本专利技术的第三方面，提出了一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病的crispr/cas12a检测体系，所述crispr/cas12a检测体系包括：上述crrna、cas12a蛋白和单链dna报告系统。
14、在本专利技术的一些实施方式中，所述cas蛋白为lbcas12a蛋白。
15、在本专利技术的一些实施方式中，所述单链dna报告系统包括用于荧光检测的ssdnafq reporter和/或用于免疫胶体金试纸条检测的ssdna fb reporter。
16、在本专利技术的一些实施方式中，所述ssdna fq reporter为利用6-羧基荧光素和荧光淬灭剂标记的单链dna，标记产物如下：5’-6fam-ttatt-tamra-3’；所述ssdna fbreporter为利用6-羧基荧光素和生物素标记的单链dna，标记产物如下：5’-6fam-ttatt-biotin-3’。
17、根据本专利技术的第四方面，提出了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病pirvpa基因的rpa引物对和crispr/cas12a检测体系。
18、在本专利技术的一些实施方式中，所述试剂盒还包括检测试纸条。
19、在本专利技术的一些实施方式中，所述检测试纸条包括胶体金检测试纸条。
20、根据本专利技术的第五方面，提出了上述crrna、rpa引物对、crispr/cas12a检测体系和试剂盒在制备检测对虾急性肝胰腺坏死病的产品中的应用。
21、在本专利技术的一些实施方式中，所述检测具体包括以下步骤：利用上述试剂盒对待测样品进行检测。
22、在本专利技术的一些实施方式中，所述检测具体包括以下步骤：
23、(1)提取待测样品dna；
24、(2)利用上述等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病pirvpa基因的rpa引物对扩增待测样品中的目的片段得到特异性rpa产物；
25、(3)将步骤(2)的扩增得到特异性rpa产物加入crispr/cas12a检测体系，进行反应后得到反应产物；将所述反应产物通过荧光或试纸条进行检测。
26、在本专利技术的一些实施方式中，步骤(2)中，所述扩增采用的反应体系包括如下组分：0.3-0.6μm rpa引物、primer free rehydration buffer 28-31μl、模板dna0.5-2μl、水11-15μl和12-15mm醋酸镁。
27、在本专利技术的一些实施方式中，所述扩增的反应条件为：35-42℃反应18-24min。
28、在本专利技术的一些实施方式中，步骤(3)中所述反应采用的反应体系如下：
29、
30、
31、在本专利技术的一些实施方式中，步骤(3)中所述反应采用的反应条件如下：35-38℃反应0.5-2h。
32、根据本专利技术的一些实施方式，至少具有如下有益效果：本专利技术方案通过将rpa技术与crispr/cas12a系统联合，针对ahpnd的毒力基因pirvpa设计特异性的检测位点，先通过等温扩增目的片段，再通过crispr检测体系特异性识别检测位点和剪切反应，最后通过试纸条或者荧光信号的方式呈现检测结果，检测快速、灵敏、特异，且不依赖大型实验设备，能将结果可视化展示，为各实验室和养殖企业提供一种快速检测ahpnd的方法选择。
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1.一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的crRNA，其特征在于，所述crRNA包括crRNA2、crRNA3、crRNA4和crRNA5中的至少一种；所述crRNA2的引物序列如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2所示；所述crRNA3的引物序列如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示；所述crRNA4的引物序列如SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6所示；所述crRNA5的引物序列如SEQ ID NO:7、SEQID NO:8所示。
2.等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病PirVPA基因的RPA引物对；所述RPA引物对的序列选自以下(1)～(5)中的至少一种：
3.一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，所述CRISPR/Cas12a检测体系包括：权利要求1所述的crRNA、Cas12a蛋白和单链DNA报告系统。
4.根据权利要求3所述的CRISPR/Cas12a检测体系，其特征在于，所述单链DNA报告系统包括用于荧光检测的ssDNA FQ reporter和/或
5.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的RPA引物对和权利要求3-5任一项所述的CRISPR/Cas12a检测体系。
6.权利要求1所述的crRNA、权利要求2所述的RPA引物对、权利要求3-4任一项所述的CRISPR/Cas12a检测体系和权利要求5所述的试剂盒中的至少一种在制备检测对虾急性肝胰腺坏死病的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测包括以下步骤：利用权利要求5所述的试剂盒对待测样品进行检测。
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述检测具体包括以下步骤：
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述扩增采用的反应体系包括如下组分：0.3-0.6μM RPA引物、Primer Free Rehydration buffer 28-31μL、模板DNA0.5-2μL、水11-15μL和12-15mM醋酸镁；
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，步骤(3)中所述反应采用的反应体系如下：
...【技术特征摘要】
1.一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病pirvpa基因的crrna，其特征在于，所述crrna包括crrna2、crrna3、crrna4和crrna5中的至少一种；所述crrna2的引物序列如seq id no:1、seq id no:2所示；所述crrna3的引物序列如seq id no:3、seq id no:4所示；所述crrna4的引物序列如seq id no:5、seq id no:6所示；所述crrna5的引物序列如seq id no:7、seqid no:8所示。
2.等温扩增对虾急性肝胰腺坏死病pirvpa基因的rpa引物对；所述rpa引物对的序列选自以下(1)～(5)中的至少一种：
3.一种用于检测对虾急性肝胰腺坏死病的crispr/cas12a检测体系，其特征在于，所述crispr/cas12a检测体系包括：权利要求1所述的crrna、cas12a蛋白和单链dna报告系统。
4.根据权利要求3所述的crispr/cas12a检测体系，其特征在于，所述单链dna报告系统包括用于荧光检测的ssdna fq reporter和/或用于免疫胶...
【专利技术属性】
技术研发人员：彭佩，秦励圆，黄思敏，唐顺学，
申请(专利权)人：华智生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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