【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及药物合成，具体涉及一种酮还原酶、酮还原酶基因、突变体及其在不对称还原制备s-玻色因中的应用。
技术介绍
1、玻色因(pro-xylanetm)是一种由水、丙二醇和羟丙基四氢吡喃三醇按一定比例组成的化妆品原料，其有效活性成分羟丙基四氢吡喃三醇(目前国内化妆品原料界将羟丙基四氢吡喃三醇等同称作玻色因)，分子式c8h18o5，分子量为192.21，具有广泛的生物活性。玻色因能促进糖胺聚糖的合成，增加真皮胶原的产生，达到促进真皮修复、改善皮肤弹性、减轻皱纹和增加皮肤紧致度的功效，从而对皮肤起到抗衰老的作用。玻色因具有多种立体构型，据文献报道(synthesisofpro-xylanetm:anewbiologicallyactivec-glycosideinaqueousmedia,bio.&med.chem.lett.19(2009)845-849)，[β,s]构型的玻色因(即s-玻色因)生物活性最优。
2、
3、玻色因和s-玻色因的结构
4、据报道，玻色因的合成方面，cavezza等以木糖为原料，在碱性条件下，与乙酰丙酮缩合反应12h，经强酸性阳离子交换树脂酸化，再用硼氢化物对羰基还原反应12h，合成玻色因。s-玻色因的合成方面，玻色因中非对映异构体的比例，可以通过对羰基还原反应条件的筛选来控制，化学/酶法都有报道(cn115819387，cn116926028)，相对于化学法，酶催化合成具有高度的化学、区域和立体选择性，反应条件温和，后处理容易，能耗较低，是一种环境友好的合
技术实现思路
1、本专利技术的目的是：提供一种酮还原酶、酮还原酶基因、突变体及其在不对称还原制备s-玻色因中的应用。
2、为解决上述技术问题，本专利技术中采用的技术方案如下：
3、一种酮还原酶，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
4、编码酮还原酶的基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
5、一种酮还原酶突变体，所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
6、seq id no.3在seq id no.1中的氨基酸序列通过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有酮还原酶活性的由seq id no.1衍生的酮还原酶。
7、进一步地，如seq id no.3所述的酮还原酶的制备包括以下步骤：
8、a.目的基因的获取：根据genbank收录的马氏克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)酮还原酶的基因序列(gene id:ab183149.1)，通过安徽通用生物有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加bamhi和xhoi限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶bamhi和xhoi酶切后，与经过同样双酶切的pet28a(+)载体进行连接、转化和筛选，筛选得到阳性质粒。从而构建该酮还原酶的体外异源表达体系。
9、b.蛋白表达：将构建后的pet28a-pflss101质粒转入大肠杆菌bl21(de3)宿主菌，37℃倒置培养过夜，菌种接种量为1％-10％，lb培养基组成：5g酵母粉；10g蛋白胨；10gnacl，ph值为7.0，用去离子水配制，200rpm培养至od600＝0.6-0.8，18℃条件下，iptg诱导表达过夜。
10、c.蛋白收菌、破碎、鉴定：将步骤b)被诱导表达的lb培养基通过离心收集细胞，并在4℃下用pbs洗涤3次；随后将细胞沉淀物按照细胞沉淀物：pbs缓冲液＝1：9中，并通过超声破碎(工作时间共30min，超3s，停7s，功率50％)，得到酮还原酶粗酶液，同时sds-page鉴定表达情况。
11、编码酮还原酶突变体的基因，其核苷酸序列如seq id no.4所示。
12、一种携带所述基因的表达载体。
13、一种重组菌，所述重组菌包含所述的酮还原酶突变体的基因。
14、酮还原酶在不对称还原制备s-玻色因中的应用，包括：构建含有所述酮还原酶突变体的基因的重组菌，以所述重组菌发酵培养获得的菌体经破碎后得的含酶制剂为催化剂，在辅酶的作用下，对式ⅱ化合物进行不对称加氢反应，得到式i化合物，反应式如下：
15、
16、酮还原酶的用量在1-6g/l(优选1.5-3g/l)，pbs缓冲液浓度为50-300mm(优选100mm)，缓冲液ph值6.0-9.0，优选7.0，辅酶浓度为0.1-0.5g/l，辅酶浓度优选0.2g/l，底物浓度在30-100g/l，优选80g/l，反应温度为20-40℃，优选30℃。
17、进一步的，所述反应的温度为20-40℃，反应ph为6.0-9.0，底物浓度为80-150g/l。
18、进一步的，所述辅酶为β烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐nadp，浓度为0.1-0.5g/l。
19、有益效果
20、本专利技术中的酮还原酶及其突变体来源于氏克鲁维酵母(kluyveromycesmarxianus)，其中，突变体酶的酶活力较野生型的增加5-10倍。
21、本专利技术中的酮还原酶及其突变体催化不对称还原制备s-玻色因中的底物浓度达到80-150g/l，手性纯度值大于99％，具有较高的工业化应用潜力。
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1.一种酮还原酶，其特征在于：所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.编码如权利要求1所述的酮还原酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。
3.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示。
4.编码如权利要求3所述的酮还原酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.4所示。
5.一种携带如权利要求2或权利要求4中任一项所述基因的表达载体。
6.一种重组菌，其特征在于：所述重组菌包含权利要求1或3中任一项所述的酮还原酶突变体的基因。
7.如权利要求1或权利要求3中任一项所述的酮还原酶在不对称还原制备S-玻色因中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用包括：构建含有所述酮还原酶突变体的基因的重组菌，以所述重组菌发酵培养获得的菌体经破碎后得的含酶制剂为催化剂，在辅酶的作用下，对式Ⅱ化合物进行不对称加氢反应，得到式I化合物，反应式如下：
9.如权利要求8所述的应用，
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述辅酶为β烟酰胺腺嘌呤双核苷酸磷酸盐NADP，浓度为0.1-0.5g/L。
...【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶，其特征在于：所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq id no.1所示。
2.编码如权利要求1所述的酮还原酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seq idno.2所示。
3.一种酮还原酶突变体，其特征在于，所述的酮还原酶突变体的氨基酸序列如seq idno.3所示。
4.编码如权利要求3所述的酮还原酶突变体的基因，其特征在于，其核苷酸序列如seqid no.4所示。
5.一种携带如权利要求2或权利要求4中任一项所述基因的表达载体。
6.一种重组菌，其特征在于：所述重组菌包含权利要求1或3中任一项所述的酮还原酶突变体的基因。
【专利技术属性】
技术研发人员：陈剑，余长泉，杨杰，
申请(专利权)人：南京桦冠生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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