一种酮还原酶、酮还原酶突变体及其编码基因和应用制造技术

本发明专利技术涉及应用微生物与酶工程领域，尤其是一种酮还原酶、酮还原酶突变体及其编码基因和应用；所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；酮还原酶基因用于编码所述酮还原酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示，酮还原酶突变体基因用于编码所述的酮还原酶突变体，其核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示。本发明专利技术中的酮还原酶及其突变体来源于乳酸假单胞菌(Pseudomonas lactis)，其催化不对称还原制备度洛西汀中间体中的底物浓度达到80g/L，手性纯度值大于99％，具有较高的工业化应用潜力。具有较高的工业化应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种酮还原酶、酮还原酶突变体及其编码基因和应用


[0001]本专利技术涉及应用微生物与酶工程领域，尤其是一种酮还原酶、酮还原酶突变体及其编码基因和应用。

技术介绍

[0002]盐酸度洛西汀(Duloxetine hydrochloride)，化学名(S)
‑
N
‑
甲基
‑3‑
(1
‑
萘氧基)
‑3‑
(2
‑
噻吩基)
‑1‑
丙胺盐酸盐，商品名欣百达，是美国礼来公司研制的一种5
‑
羟色胺和去甲肾上腺素再摄取的双重抑制剂(SNRIs)。临床上应用其治疗抑郁症、压力性尿失禁、抑郁症伴发慢性疼痛、糖尿病周围神经病性疼痛。
[0003][0004]盐酸度洛西汀结构式
[0005]研究发现(S)
‑
构型的盐酸度洛西汀药效是(R)
‑
构型的两倍，因而(S)
‑
构型手性醇中间体的制备是盐酸度洛西汀合成的关键步骤。目前，(S)
‑
构型手性醇中间体的制备主要有化学合成法和生物酶催化合成法两种方法。化学合成采用化学拆分和化学不对称合成来制备(S)
‑
构型手性醇中间体，化学合成法反应步骤长、溶剂消耗多、原子经济性低，从而导致污染大、成本高。
[0006]与化学合成法相比，生物酶催化合成法具有高度的化学、区域和立体选择性，反应条件温和，后处理容易，能耗较低，是一种环境友好的合成方法，也是当今化工生产和相关领域发展一大潮流。已有多篇文献报道了度洛西汀(S)
‑
构型手性醇中间体的合成(Wada M,et al.Biosci Biotechnol Biochem,2004,68:1481
‑
1488；St
ü
rmer R,et al.,2008,US0318288A1；Tang CG,et al.Biotechnol Lett,2011,33:1435
‑
1440)。然而上述利用酮还原酶来进行手性醇制备的研究中，底物浓度低(<30g/L),且所制备的手性醇还需经过几步化学反应才能制得度洛西汀手性中间体(S)
‑
N
‑
甲基
‑3‑
羟基
‑3‑
(2
‑
噻吩基)
‑1‑
丙胺，限制了其工业化应用。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是：提供一种酮还原酶、酮还原酶突变体及其应用。
[0008]为实现上述目的，本专利技术中采用的技术方案如下：
[0009]一种酮还原酶，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]一种酮还原酶基因，所述酮还原酶基因用于编码权利要求1所述的酮还原酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0011]一种酮还原酶突变体，所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012]一种酮还原酶突变体基因，所述酮还原酶突变体基因用于编码权利要求3所述的酮还原酶突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0013]一种携带前述基因的表达载体。
[0014]一种重组菌，所述酮还原酶的重组菌包含前述的表达载体。
[0015]前述酮还原酶或酮还原酶突变体在不对称还原制备度洛西汀中间体中的应用。
[0016]进一步的，酮还原酶或酮还原酶突变体催化制备不对称还原制备度洛西汀中间体的具体方法如下：
[0017][0018]进一步的，反应pH为6.0
‑
9.0。
[0019]进一步的，反应温度为20
‑
40℃。
[0020]有益效果
[0021]本专利技术中的酮还原酶及其突变体来源于乳酸假单胞菌(Pseudomonas lactis)，其催化不对称还原制备度洛西汀中间体中的底物浓度达到80g/L，手性纯度值大于99％，具有较高的工业化应用潜力。
具体实施方式
[0022]下面通过实施例的方式进一步说明本专利技术，但并不因此将本专利技术限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。如没有特别强调温度，通常指在室温下进行反应，本专利技术中的室温是指10～30℃。
[0023]本专利技术的技术方案：本专利技术首先从表达酮还原酶的重组大肠杆菌出发制备酮还原酶粗酶，通过控制反应pH、反应温度、了解酮还原酶催化的性质和功能，获得较好的催化效果。在此基础上，对该粗酶体系催化不对称还原制备度洛西汀中间体转化效果进行考察。
[0024]下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。其中所述室温为本领域常规室温，室温范围是20
‑
40℃。
[0025]E.coli DH5a和E.coli BL21(DE3)感受态细胞，购自北京天根生化科技有限公司。本专利技术中的酮还原酶和酮还原酶突变体的制备方法如下：
[0026]获取SEQ ID NO.2所述的酮还原酶；
[0027]SEQ ID NO.3在SEQ ID NO.2中的氨基酸序列通过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸且具有酮还原酶活性的由SEQ ID NO.2衍生的酮还原酶。
[0028]本专利技术中的如SEQ ID NO.3所述的酮还原酶的制备包括以下步骤：
[0029]a.目的基因的获取：通过安徽通用生物有限公司全基因合成所得，在编码区两端分别添加BamHI和XhoI限制性内切酶位点。目的基因片段通过限制性内切酶BamHI和XhoI酶切后，与经过同样双酶切的pET28a(+)载体进行连接、转化和筛选，筛选得到阳性质粒。从而构建该酮还原酶的体外异源表达体系。
[0030]b.蛋白表达：将构建后的pET28a
‑
PFLSS101质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌，
37℃倒置培养过夜，菌种接种量为1％
‑
10％，LB培养基组成：5g酵母粉；10g蛋白胨；10g NaCl，pH值为7.0，用去离子水配制，200rpm培养至OD600＝0.6
‑
0.8，18℃条件下，IPTG诱导表达过夜。
[0031]c.蛋白收菌、破碎、鉴定：将步骤b)被诱导表达的LB培养基通过离心收集细胞，并在4℃下用PBS洗涤3次；随后将细胞沉淀物按照细胞沉淀物：PBS缓冲液＝1：9中，并通过超声破碎(工作时间共30min，超3s，停7s，功率50％)，得到酮还原酶粗酶液，同时SDS
‑
PAGE鉴定表达情况。
[0032]本专利技术中的酮还原酶不对称催化制备度洛西汀中间体的方法，如下：
[0033][0034]酮还原酶的用量在1
‑
6g/L(优选1.5
‑本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶，其特征在于：所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.一种酮还原酶基因，其特征在于：所述酮还原酶基因用于编码权利要求1所述的酮还原酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。3.一种酮还原酶突变体，其特征在于：所述酮还原酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.一种酮还原酶突变体基因，其特征在于：所述酮还原酶突变体基因用于编码权利要求3所述的酮还原酶突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。5.一种携带权利要求2或权利要求4所述基因的表达载体。6.一种用于制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈剑，余长泉，杨杰，
申请(专利权)人：南京桦冠生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：