全合成酮还原酶及应用该酮还原酶的制备方法技术

本发明专利技术涉及合成技术领域，特别是涉及基因工程与酶工程合成技术领域，具体而言，涉及全合成酮还原酶及应用该还原酶的制备方法。通过全合成的方法获得了一种新的酮还原酶，该酮还原酶能够稳定异源功能性表达，同时该酮还原酶能够在替格瑞洛合成关键中间体化合物(S)

【技术实现步骤摘要】
全合成酮还原酶及应用该酮还原酶的制备方法


[0001]本专利技术涉及合成
，特别是涉及基因工程与酶工程合成
，具体而言，涉及全合成酮还原酶及应用该还原酶的制备方法。

技术介绍

[0002]手性醇化合物作为天然产物和手性药物合成中的重要中间体化合物，其合成一直是本领域技术人员研究的热点。手性化合物合成中手性中心的构建是合成中的关键环节，不同的手性化合物其药理活性、代谢及毒性都有着重大差异。对于手性药物，通常一组对映体中，一个是活性有效的，而另一个是无效，甚至是有毒的。
[0003]譬如，替格瑞洛合成中的关键中间体化合物(S)
‑2‑
氯
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(3,4
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二氟苯基)乙醇和富马酸丙酚替诺福韦合成中的关键中间体化合物(R)
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(2
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羟丙基)腺嘌呤都是手性中间体，其光学纯度在目标药物化合物的制备中起着至关重要的作用。
[0004]还原酶作为生物催化剂在生物法合成中具有重要作用。但是在还原酶的应用中，能否异源表达，表达效果好坏，以及能否有效、高效催化底物转化为目标光学手性化合物，都需要具体问题具体分析。在现有技术中，还原酶往往只能单一作用在某一底物转化合成中，针对不同的手性化合物的需要，必须要构建不同的催化酶。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种全合成酮还原酶，并利用该全合成酮还原酶作为生物催化剂，提供一种新的合成替格瑞洛合成关键中间体化合物(S)
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氯
‑1‑
(3,4
‑
二氟苯基)乙醇和合成富马酸丙酚替诺福韦关键中间体化合物(R)
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(2
‑
羟丙基)腺嘌呤的方法，进而不仅得到高光学纯度的目标化合物，同时能够实现一酶两用。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种酮还原酶，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0007]同时，本专利技术还公开了该酮还原酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0008]同时，本专利技术还公开了一种连接有上述编码基因的重组质粒。优选地，该重组质粒为pET
‑
28a(+)。
[0009]进一步地，在本专利技术中还公开了重组质粒的构建方法，分别设计如SEQ ID NO：3所示的上游引物P1和如SEQ ID NO：4所示的下游引物P2，将pET
‑
28a(+)质粒BamH I和XhoI双酶切处理后，将经PCR扩增的含有BamH I和XhoI酶切位点含有如SEQ ID NO：2所示的编码基因的目的基因与载体pET
‑
28a(+)连接，所用连接体系为目的基因4μL，载体pET
‑
28a(+)2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜。
[0010]进一步地，本专利技术还公开了PCR扩增的条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix25μL；其中模板为pUC57。
[0011]同时，本专利技术还公开了含有上述重组质粒的宿主细胞。优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。
[0012]另一方面，本专利技术还公开了应用该酮还原酶的制备化合物(S)
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氯
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(3,4
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二氟苯基)乙醇的方法，将重组工程菌培养、破碎后添加至含有底物化合物Ⅱ、NADP
+
、异丙醇和异丙醇还原酶酶粉的反应体系中，经反应形成化合物Ⅰ，所述重组工程菌是以E.coliBL21(DE3)为宿主，pET
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28a(+)为载体，表达如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶的大肠杆菌，
[0013][0014]在另一个专利技术，本专利技术还公开了应用该酮还原酶制备化合物(R)
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(2
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羟丙基)腺嘌呤的方法，将重组工程菌培养、破碎后添加至含有底物化合物Ⅳ、NADP
+
、异丙醇和异丙醇还原酶酶粉的反应体系中，经反应形成化合物Ⅲ，所述重组工程菌是以E.coliBL21(DE3)为宿主，pET
‑
28a(+)为载体，表达如SEQ ID NO：1所示的酮还原酶，
[0015][0016]进一步优选地，所述重组工程菌培养方法如下：将重组菌接种于培养基中，37℃震荡培养过夜，按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl0.5mol/L的诱导剂，16～25℃诱导16h，离心收集菌体。
[0017]进一步优选地，所述重组工程菌采用超声波破碎的方式，超声功率为260W，超声程序为运行3s，间隔5s，总时长3min。
[0018]进一步优选地，所述酮还原酶在反应体系中的浓度为0.04g/mL。
[0019]本专利技术通过全合成的方法获得了一种新的酮还原酶，该酮还原酶能够稳定异源功能性表达，同时该酮还原酶能够在替格瑞洛合成关键中间体化合物(S)
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氯
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(3,4
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二氟苯基)乙醇的制备中和富马酸丙酚替诺福韦关键中间体化合物(R)
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(2
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羟丙基)腺嘌呤的制备中均表现出高效地催化活性，具有巨大的工业化应用潜力，有望成为催化不同手性构型的通用酮还原酶。
具体实施方式
[0020]为了更好的理解本专利技术，下面我们结合具体的实施例对本专利技术进行进一步的阐述。
[0021]实施例1酮还原酶的构建
[0022]设计酮还原酶的上下游引物F、R(如表1所示)，以全基因合成构建的pUC57
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D_001为模板，通过PCR的方式扩增含有BamH I和XhoI酶切位点的D
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001基因。
[0023]PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环。
[0024]PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL。
[0025]采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。BamH I和XhoI酶酶切胶回收产物及pET
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28a(+)质粒(表达载体)，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。
[0026]目的基因D_001与载体pET
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28a(+)连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET
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28a2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接。
[0027]将构建好的载体通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种酮还原酶，其特征是，所述酮还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.一种DNA分子，其特征是，所述DNA分子含有编码权利要求1所述的酮还原酶的编码基因，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。3.一种重组质粒，其特征是，所述重组质粒连接有权利要求2所述的DNA分子，进一步优选地，该重组质粒为pET
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28a(+)。4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征是，所述重组质粒是通过以下方法构建，分别设计如SEQ ID NO：3所示的上游引物P1和如SEQ ID NO：4所示的下游引物P2，将pET
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28a(+)质粒BamH I和XhoI双酶切处理后，将经PCR扩增的含有BamH I和XhoI酶切位点含有如SEQ ID NO：2所示的编码基因的目的基因与载体pET
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28a(+)连接，所用连接体系为目的基因4μL，载体pET
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28a(+)2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜。5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征是，PCR扩增的条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，35个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTARMix25μL；其中模板为pUC57。6.一种宿主细胞，其特征是，所述宿主细胞含有上述重组质粒，优选地，该宿主细胞为大肠杆菌。7.应用权利要求1所述的酮还原酶制备化合物(S)
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氯

【专利技术属性】
技术研发人员：戚陈陈，邬小兵，张康，杨柳，
申请(专利权)人：重庆普佑生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：