【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及酶催化，具体领域为一种转氨酶及其在生产西他列汀中间体的应用。
技术介绍
1、西他列汀(sitagliptin)是由美国merck公司和codexis公司研制和开发，是首个获得fda批准用于治疗ⅱ型糖尿病的二肽基肽酶-iv(dpp-iv)抑制剂。西他列汀能够血糖依赖性地增加胰岛素的分泌，降糖作用较为适中，不会引发低血糖的发生，并且无增加体重、恶心、呕吐等副作用。
2、西他列汀及其中间体可由化学-酶法相结合制得，逐步成为合成手性医药化学品及其中间体的首选方案。对于化学-酶法而言关键就是要获得一种转氨酶，其能够催化不对称转氨反应得到光学纯的西他列汀中间体。美国专利us8293507公开了codexis公司对节杆菌来源的转氨酶(ata117)进行改造得到的生物催化剂，转氨得到的产物ee值达到99％。
3、但是，目前常用的转氨酶耐温性较差，最适反应温度多在50℃以内，而在60℃以上则迅速失活；而且大部分转氨酶不适合在高ph下进行催化反应。
4、因此，本专利技术试图寻找一种转氨酶突变体来解决上述问题，既可以让转氨酶耐受高温和高ph，同时可保持较高的酶活，扩大转氨酶的应用范围。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于提供一种转氨酶及其在生产西他列汀中间体的应用。
2、为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
3、一种转氨酶，其氨基酸序列如seq id no：3所示。
4、本专利技术所述转氨酶可用于生产西他列
5、其中，所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
6、(1)通过引物拼接的方法，将seq id no：3所示蛋白的对应编码多核苷酸序列进行组装，并克隆到原核表达载体，以实现在大肠杆菌中的高表达；
7、(2)采用摇瓶发酵或者分批补料发酵
8、①摇瓶发酵
9、挑取含有表达载体的大肠杆菌单菌落接种于3ml高压灭菌后的培养基a中，30℃，250rpm过夜培养；所述培养基a为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.8g/l，添加卡那霉素至50mg/l；
10、次日取1l三角瓶，按1：100的接种比例接入到250ml高压灭菌后的培养基b中，于37℃中培养至菌体od 5-6，立刻将三角瓶置于25℃摇床中，250rpm培养1小时；加iptg至终浓度0.1mm，并于25℃，180rpm继续培养12小时；所述培养基b为：胰蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸氢二钠3.55g/l，磷酸二氢钾3.4g/l，氯化铵2.68g/l，硫酸钠0.71g/l，七水硫酸镁0.493g/l，六水氯化铁0.027g/l，甘油5g/l，葡萄糖0.3g/l，添加卡那霉素至50mg/l；
11、培养结束后，将培养液于4℃，12000g下离心20分钟收集湿菌体；然后将菌体沉淀用蒸馏水清洗1次，收集菌体，-70℃保存；同时取少量菌体进行sds-page检测；
12、②分批补料发酵
13、分批补料发酵在计算机控制的生物反应器中进行，将含有表达载体的大肠杆菌单菌落制备200ml培养物，当培养物为od2.0时接入所述生物反应器；在整个发酵过程中，温度保持37℃，发酵过程中溶解氧浓度由搅拌速率和通气供应级联自动控制在30％，而培养基的ph值由50％v/v正磷酸和30％v/v氨水维持在7.0；发酵过程中，当出现溶氧回升时，开始补料，补料溶液含有9％w/v蛋白胨、9％w/v酵母提取物、14％w/v甘油；当od600为50.0时，控制温度为25℃，并用0.1mm iptg诱导表达16小时，离心收菌体-25℃保存。
14、其中，分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/l，蛋白胨12g/l，0.4％w/v葡萄糖，2.31g/l磷酸二氢酶和12.54g/l磷酸氢二钾，ph 7.0。
15、与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：
16、本专利技术的转氨酶可用于催化1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮生成西他列汀中间体(r)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮。该转氨酶与野生型转氨酶相比，不仅酶活测定更高，并且在特定反应条件下(50℃-55℃，ph 9.0-9.5)具有更高的底物转化率和产物浓度。
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1.一种转氨酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.权利要求1所述转氨酶在生产西他列汀中间体的应用。
3.根据权利要求2所述的转氨酶在生产西他列汀中间体的应用，其特征在于：分别称取1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮、二甲基亚砜、磷酸吡哆醛、异丙胺至烧瓶中，加入pH 9.0-9.5的三乙醇胺-HCl缓冲液，在温度50～55℃水浴中，加入转氨酶的粗酶液进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮。
4.根据权利要求3所述转氨酶在生产西他列汀中间体中的应用，其特征在于：所述粗酶液的制备方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述转氨酶在生产西他列汀中间体中的应用，其特征在于：粗酶液制备方法中，分批补料发酵所用的培养基为：酵母抽提物24g/L，蛋白胨12g/L，0.4％w/v葡萄糖，2.31g/L磷酸二氢酶和12.54g/L磷酸氢二钾，pH 7.0。
【技术特征摘要】
1.一种转氨酶，其特征在于：其氨基酸序列如seq id no：3所示。
2.权利要求1所述转氨酶在生产西他列汀中间体的应用。
3.根据权利要求2所述的转氨酶在生产西他列汀中间体的应用，其特征在于：分别称取1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮、二甲基亚砜、磷酸吡哆醛、异丙胺至烧瓶中，加入ph 9.0-9.5的三乙醇胺-hcl缓冲液，在温度50～55℃水浴中，加入转氨酶的粗酶液进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得...
【专利技术属性】
技术研发人员：李佰卫，王雷，
申请(专利权)人：浙江乾至科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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