人类子宫颈干细胞群及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于分离干细胞的方法，包括由子宫颈组织制备细胞悬浮液，涉及由所述方法分离的干细胞以及由所述干细胞的培养物获得的条件培养基。本发明专利技术还涵盖所述干细胞或条件培养基在用于治疗或预防癌症、癌前病变、炎性疾病、自身免疫性疾病、慢性病症或感染性疾病，与组织损失相关的疾病，或在用于诊断、预后或治疗生育障碍，以及在用于美容治疗中的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种用于分离干细胞的方法，所述方法包括由子宫颈组织制备细胞悬 浮液，涉及由所述方法分离的干细胞，并且涉及从所述干细胞的培养物获得的条件培养基 (条件培养液，conditioned medium)。本专利技术还涵盖所述干细胞或条件培养基在用于治疗 或预防癌症、炎性疾病、自身免疫性疾病慢性病症或感染性疾病，以及用于美容治疗中的应 用。因此，本专利技术涉及干细胞及其治疗或美容用途的领域。
技术介绍
干细胞的特征在于其自我更新和沿多谱系途径分化的能力。一种特别有前景的类 型的用于治疗应用的成体干细胞是所谓的间充质干细胞（MSC)。MSC，也被定义为多能间充 质基质细胞，是在体外作为塑料贴壁细胞增殖的细胞的异质群体，具有成纤维细胞样形态， 在体外形成集落，并且可以分化成中胚层谱系的细胞，如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞，以 及其他胚胎谱系的细胞。 干细胞被认为存在于微环境（小生境，niche)中，其调节干细胞自我更新和组织 再生之间的平衡。干细胞微环境的概念最初参照哺乳动物造血描述，其中微环境代表了容 纳造血干细胞并保证其继续存在的专门的微环境。已经提出，微环境中的具有其分泌产物 的支持细胞会与干细胞行为相互作用并控制干细胞行为。为了支持干细胞的活性，根据该 模型，微环境内的条件在没有任何外部激活线索的情况下将有利于维持干细胞静止，但会 促进将需要出现的祖细胞的增殖和成熟，并且还将确保干细胞池的自我更新。 一些作者已经报道了在来源于胚胎中胚层的软组织中存在多能成体细胞的不同 群。例如，已经报道了多能细胞可以从哺乳动物的骨骼肌和其他结缔组织、从人类脂肪 (lipoaspirated)组织或从骨髓中获得。原则上，所有这 些分离的细胞群可以以与骨髓的MSC相似的方式用于结缔组织的修复和再生。然而，除了 MAPC，到目前为止，这些群均没有在表型水平被充分地表征。因此，尽管已经描述了在不同 的结缔组织中存在多能成体细胞，但是在本领域的当前状态，不可能识别和明确区分从软 组织中获得的不同的多能细胞类型，或者不可能获得基本上纯的群。目前，干细胞的表型特 征包括标记物的确定，尤其是如细胞表面受体；以及在体外培养中它们的分化能力的确定。 每种细胞类型具有表面标记物的某种组合，也就是说，它具有表达的某种分布，其表征了该 特定细胞类型，从而将其与其他区分开。 成体干细胞的理想来源是在其中它们可以通过简单的、非侵入性的方法获得的来 源和允许足够数量细胞被分离的来源。特别是，来源应提供干细胞，该干细胞在没有重大风 险和不适的情况下可以容易地从活的受试者分离，并且该来源应该允许高产率以从其他细 胞类型以最小的污染获得，而没有过高的分离和培养的成本。 虽然骨髓（BM)已经是用于多能MSC的分离的主要来源，脂肪组织是该细胞的另一 来源，但是BM和脂肪组织的收获是高度侵入性的过程。一个可替换的来源是脐带血，其可 以通过微创程序来获得，而不损害母亲或婴儿。在各种其他人类成体组织（包括胎盘、头皮 组织和肠干细胞）中识别了 MSC的其他来源。从BM、脂肪组织或脐带血液（UCB)分离的所 有细胞表现出典型的MSC特征：成纤维细胞形态、集落形成单位-成纤维细胞（CFU-F)的形 成、多能分化能力和一组典型的表面蛋白的表达。而来自三个来源的MSC表达了经典的MSC 标记蛋白，观察到关于⑶90、⑶105和⑶106的表达的显著差异。因此，MSC依据其来源可 以显示出不同的表型。 获得骨髓的过程是痛苦的且产量非常低，通过体外扩增使细胞的数量显著增加是 必要的，以获得临床相关量。这个步骤增加了成本且使得该过程耗费时间，以及增加了材料 的污染和损失的风险。由于这些原因，非常期望能够从除了骨髓的间充质组织中分离多能 细胞。特别是，鉴于它们的手术可及性，方便的是能够从非骨软骨中胚层组织中分离细胞， 如但不限于，皮肤、脂肪和肌肉组织。 因此，在现有技术中存在通过非侵入性和无痛收获来提供干细胞的可替代来源的 必要性。在这个意义上，子宫可以是干细胞的来源。然而，子宫是一个被分成不同部分的复 杂器官。具体地，人类子宫是一个纤维肌性器官，其可分为上肌子宫体和延伸到阴道中的下 纤维子宫颈。子宫体分为子宫底和子宫下段（或峡部），其大约在子宫动脉的过程和子宫颈 内口的水平。子宫颈是一个窄的圆柱形通道，在其下端其与阴道连接，且在其上端，子宫颈 变宽以形成子宫下段（峡部）；子宫下段进而加宽至子宫底（图18)。在妇科检查期间可以 从阴道内看见的子宫颈的下端被称为外宫颈。在外宫颈中心的开口（其被称为外口）打开 以允许子宫和阴道之间的通路。宫颈内膜环绕子宫颈内腔，其是通过子宫颈从外口进入子 宫的通道（图19)。宫颈内膜和外宫颈之间的重叠边界被称为转化区。转化区是其中优选 收集本专利技术的干细胞的区域。 著名的加拿大组织学家Arthur Worth Ham，在他的教科书"Histology"（Ham, A. W. and Cormack，D. H. Ham，s Histology, 9th ed. Philadelphia:Lippincott，1987)(由许多 从业者推崇的不可或缺的参考文献）中描述了子宫体和子宫颈的不同的组织层。人类子宫 体由以下三个组织层组成：1)称为子宫内膜的内层是最活跃的层，并响应于循环性卵巢激 素的变化；子宫内膜是高度专门化的并且是月经和生殖功能必不可少的（来源于这个组织 层的子宫内膜干细胞）；2)中间层，或子宫肌层，构成了子宫体积的大部分，且是肌肉层，主 要由平滑肌细胞组成（来源于这个组织层的子宫肌层干细胞）；以及3)子宫的外层，浆膜 或子宫外膜，是一薄层由包住子宫的上皮细胞制成的组织。然而，子宫颈壁和内衬管的膜均 具有与子宫体不同的特性。事实上，子宫颈壁主要由结缔组织构成。子宫颈由被称为黏膜的 内衬组成，其由薄的、平坦的、鳞片状的被称为鳞状细胞的细胞和称为浆膜（光滑覆盖物） 的外衬组成。此外，子宫体的连接子宫颈的部分的壁，称为子宫下段或峡部，主要由平滑肌 构成。因此，组织学并且于是子宫的这两个部分（包括子宫下段的子宫体以及子宫颈）的 功能是不同的。 国际申请W02011/042547公开了一种方法，用于从子宫肌层组织（特别地从子宫 颈上方的区域）提供干细胞，称为子宫体，其包括子宫底和子宫下段。而且，作者提到子宫 肌层的外植体（explant)通过脱落而取自子宫体的子宫下段。因为如上所述，子宫下段是 子宫颈的上端和在解剖学和组织学上与子宫颈不同的子宫体的考虑部分。然而，传统地已 知，下部子宫体的壁主要是由子宫肌层组织构成，因为子宫内膜层降低至该水平。尽管如 此，子宫颈的外壁主要由结缔组织构成。因此，不可能通过浅表细胞学取样从子宫颈获得子 宫肌层组织。因此，通过侵入性方法（如活组织检查、子宫肌层组织切片、子宫肌层移植体 或如子宫脱落物）获得生物材料，这需要一个高等级的脱落物以获得子宫肌层。因此，在用 于分离子宫肌层前体之间将子宫内膜、浆膜、脂肪和纤维组织的组织样本进行修整。在国际 申请W02011/042547中描述的干细胞群体表达了表面标记，如⑶31、⑶34和HLA-DR，其是 来自造血谱系的表面标记。相反，间充质干细胞不表达这些造血标记。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于分离干细胞的方法，包括：(a)由子宫颈组织制备细胞悬浮液；(b)从所述细胞悬浮液回收所述细胞；(c)在合适的细胞培养基中且在使细胞增殖的条件下孵育所述细胞；以及(d)选择所述干细胞。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：弗朗西斯科·约瑟·韦佐索·皮涅罗，罗马·佩雷斯·费尔南德斯，诺埃米·亿诺·迪亚兹，
申请(专利权)人：子宫干细胞研究基金会，
类型：发明
国别省市：西班牙;ES