本发明专利技术涉及合成或动物来源的3维（3D）生物支架作为基体用于提高hPS（人类多能干细胞）的生长和分化的应用；这些支架适合与现有的细胞培养实验室塑料器皿一起使用。更具体地说，本发明专利技术涉及用hPS细胞接种单独的或具有各种生物基质涂层的这些支架，以提高所述hPS细胞分化成肝细胞或肝细胞样细胞类型。本发明专利技术还涉及将部分分化的肝细胞祖细胞接种到支架上，以进一步分化成更成熟的肝细胞细胞类型。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及合成或动物来源的3维(3D)生物支架作为基体用于提高hPS (人类多能干细胞)的生长和分化的应用；这些支架适合与现有的细胞培养实验室塑料器皿一起使用。更具体地说，本专利技术涉及用hPS细胞接种单独的或具有各种生物基质涂层的这些支架，以提高所述hPS细胞分化成肝细胞或肝细胞样细胞类型。本专利技术还涉及将部分分化的肝细胞祖细胞接种到支架上，以进一步分化成更成熟的肝细胞类型。
技术介绍
哺乳动物细胞培养多年来，哺乳动物细胞培养方法已被改善和标准化，并且允许细胞生长、扩增和分化所需要的条件已被充分确定。细胞可以在无菌塑料表面例如聚苯乙烯上常规培养，所述塑料表面往往与基质涂层一起使用，所述基质涂层被设计成更接近地重现细胞会正常生长的体内环境。在胚胎干细胞的情况下，往往需要饲养细胞层例如小鼠胚胎成纤维细胞层来为营养和支持所述细胞的·增殖提供更好的基体。典型地，哺乳动物细胞被培养在通常含有添加剂例如胎牛血清的支持性培养基中，所述培养基除了向细胞提供各种激素和生长因子之外，还含有同样有助于复现细胞生长的理想微环境的许多细胞基质组分。当前，哺乳动物细胞培养具有各种各样的下游应用，包括它们在基础研究中的应用、它们在药物和毒理学分析中的应用和它们在产生正确折叠的重组哺乳动物蛋白中的应用。最近，哺乳动物细胞培养已被进一步开发用于再生医学领域，由此获取组织例如皮肤真皮层并将其增殖一定的时间段，以便生成更大量的组织以供临床外科用，例如修复外伤性损伤之后的伤口或修复患病的内脏器官。可是，从原代来源获得的细胞在它们进一步增殖的能力方面往往非常有限，并需要复杂的生长培养基配方和生长条件来进行成功培养。由于免疫排斥的问题，它们在再生医学中的应用也有限。最近，在旨在越过这些障碍的胚胎干细胞研究领域中有许多进展。这种多能干细胞不仅能够几乎无限地增殖，它们还具有分化成构成完全发育的生物体的每种细胞和组织类型的能力。因此，多能干细胞在开发新药的试验中可能是重要的工具，并且因为它们的供应实际上是无限的，因此它们提供了更廉价并且可变性较少的来源。3D生物支架多能干细胞分化中的主要挑战之一是控制分化，使得始终产生成熟、功能完全的细胞类型而不是部分分化、不成熟的前体细胞或各种细胞类型的高度异质性混合物。使多能干细胞分化的最简单方式是在2D塑料基体上，但不幸的是，这往往产生缺乏成熟细胞类型的特征性表型的分化细胞。这部分是由于不能复现干细胞在正常胚胎发生期间所经受的条件，正常胚胎发生过程与2D培养物的不同之处在于它当然是在3维中发生的。研究人员试图解决这个问题的一种方式是开发新的3D培养系统，所述新的3D培养系统旨在更忠实地复现细胞在胚胎发生期间所经受的一些条件并让它们以更天然的方式分化。特别是，这样的3D系统允许细胞在更大的程度上彼此相互作用，并允许开发比利用2D细胞培养观察到的任何物体更类似于功能性器官的复杂的多细胞聚集体。3D系统依赖于生物活性支架的存在，细胞可以接种并可以粘着在所述支架上。这样的支架必须有助于引导细胞以所需的3D构造生长和增殖，并且也可能需要提供帮助细胞形成所需结构的某些分子信号。生物支架的另一个重要要求是它们是可放大的，以便组织生长和细胞分化可以在更大、更经济的规模上进行。支架可以由各种材料构成，正确的支架选择在引导接种到其上的任何细胞的生长、增殖和分化中可能是关键的。例如，支架通常由安排成多孔海绵形式的聚合材料构成。于是，接种到这种支架中的细胞可以通过支架内部相互连接的管道和通道网络在所述支架的孔结构内部粘着和生长，当选择适合的支架时，孔径是重要的考虑因素。生体活性剂例如细胞外基质(ECM)组分，在沉积到支架表面上时，也可以用来增强支架功能，以容许更好的细胞粘着。最终的结果是为细胞提供一种体外环境，使细胞可以在其中更切实可行地并且以更接近地类似于它们正常的体内家园的方式进行相互作用。在几种培养系统中，添加细胞外基质诱导细胞极性和组织的组织化。例如，当用第二层胶原蛋白进一步覆盖培养在平的胶原蛋白层上的单层原代肝细胞时，即所谓的夹心培养，与常规2D培养物的肝细胞相比，所述细胞显示出形态和功能改善(Dunn，J.等，1991)。所述覆盖层导致细胞保持肌动蛋白丝与体内状态相似，与此相反，在2D对照培养中看到异常的应激纤维形成(Berthiaume，F.等，1996)。生理更相关的细胞骨架组织化和随后的细胞极性与形状可能引起肝功能性提高，但是后来认为，夹心培养的有益效应主要起因于改善的细胞-细胞接触而不是细胞与细胞外基质的接触(Hamilton, G.等,2001)。胶原蛋白支架也已被用于将胚胎干细胞分化成肝细胞。Baharvand和同事发现，与传统2D中分化的细胞相比，肝细胞样细胞在胶原蛋白支架内部的分化改善了形态特征、基因表达模式和代谢活性(Baharvand, H.等，2006 )。藻酸盐提供了多孔非粘着 性3D支架，支持肝细胞聚集形成强烈的细胞-细胞相互作用，导致肝功能改善(Dvir-Ginzberg, M.等,2003)。藻酸盐基质中的环境还支持新生大鼠肝细胞的分化(Dvir-Ginzberg, M.等,2008)和 HepG2 成熟(Elkayam, T.等,2006)为更成熟的功能性表型。另外，当将C3A肝细胞系作为球状体在藻酸盐中进行培养时，因为许多不同CYP的酶活性比在2D单层培养中增加，因此，C3A肝细胞系显示出药物代谢提高(Elkayam, T.等,2006)。最近,市场上已推出几种用于提供3D支架以支持细胞培养的新产品，包括已被发现改善肝细胞培养条件的3D交织纳米纤维支架(Wang, S.等,2008)。另夕卜，多孔聚苯乙烯支架提供了空间，能够让细胞生长和分化并形成具有复杂的3D细胞-细胞相互作用的层(Bokhari, M.等,2007a ;Bokhari, M等,2007b)。在这些支架中，HepG2响应于生化试剂的方式远比在2D中培养的细胞更加类似于体内组织的活性(Bokhari, M.等，2007a)。另外，小鼠ES细胞在灌流的聚氨酯泡沫中已作为球状体成功地向肝细胞分化，目的在于通过组合生长因子处理和多细胞球状体形成来发展大量分化培养法(massdifferentiation culture method) (Matsumoto, K.等，2008)。肝细胞培养肝功能衰竭和终末期肝脏疾病在全世界造成为数巨大的死亡并且是医疗保健系统的主要负担。肝脏移植仍然是最成功的治疗。可是，这种方法的功效有限并且与许多并发症例如感染或排斥关联。肝脏移植还具有可利用的供体器官短缺的缺点，并且被治疗的患者往往需要终身免疫抑制治疗。通过减少对器官的需要，基于细胞的治疗对于社会和患有这些严重疾病的个体都将是极为重要的。此外，肝脏是人体中代谢和解毒的中心，因此为了鉴定用于体外试验的功能性细胞类型的可靠来源，已经进行了大量的尝试。不幸的是，目前可利用的任何细胞类型都不能真实反映肝脏的复杂性和功能。从hPS细胞生成肝细胞样细胞的方法往往包括胚状体的形成和/或基于添加细胞毒性化合物进行早期选择，所述肝细胞样细胞可以进一步分化成成熟肝细胞(Rambhat I a, L.等,2003)。这些选择步骤,特别是胚状体的形成,往本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.06.11 DK PA201000515;2010.06.11 US 61/353,6781.关于将人类多能干细胞(hPS)或肝细胞前体细胞分化成肝细胞祖细胞、肝细胞样细胞或成熟肝细胞的方法，所述方法包括以下步骤: i)在2维表面上接种和生长hPS或肝细胞前体细胞以起始分化 ii)将步骤i)的初始分化的细胞转移到3维(3D)支架上用于进一步分化和成熟。2.权利要求1的方法，其中细胞在3D支架上的接种密度高于在2D培养物上的接种密度，例如高三倍或高五倍或高十倍。3.权利要求1的方法，其中在细胞存活因子例如ROCKRho激酶抑制剂的存在下接种细胞。4.述权利要求任一项的方法，其中在无饲养细胞的条件下执行步骤i)或ii)中的至少一个。5.述权利要求任一项的方法，其中在无异源的条件下执行步骤i)或ii)中的至少一 个。6.述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞或肝细胞前体细胞是无异源的细胞，例如来源于无异源的hPS细胞系。7.述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞是人类胚胎干(hES)细胞。8.述权利要求任一项的方法，其中hPS细胞是诱导的多能干(iPS)细胞。9.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞是定型内胚层(DE)细胞。10.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞不是定型内胚层(DE)细胞。11.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞具有胚胎内胚层的特征。12.权利要求1-6任一项的方法，其中肝细胞前体细胞具有肝内胚层的特征。13.述权利要求任一项的方法，其中在2至25天、例如4至15天之后，将步骤i)中获得的细胞转移到3D支架上(步骤ii)。14.述权利要求任一项的方法，其中3D支架选自下列之一: i)多孔藻酸盐海绵 ii)可生物降解的聚氨酯脲(PUUR)聚合物 iii)乳液模板型聚苯乙烯 iv)合成纳米纤维复合物 V)具有至少一个非直立侧壁的微孔装置 vi)由聚L-乳酸[PLLA]制造的多孔海绵。15.权利要求14的方法，其中3D支架是孔径为50-200μ M的多孔藻酸盐海绵。16.权利要求14的方法，其中3D支架是孔径在0.11000 μ Μ、例如15-45 μ M范围内的乳液模板型聚苯乙烯支架。17.述权利要求任一项的方法，其中3D支架是未涂覆的。18.权利要求1-16任一项的方法，其中用一种或多种细胞外基质组分预先涂覆3D支架。19.权利要求18的方法，其中一种或...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨内·延森，
申请(专利权)人：塞拉帝思股份公司，
类型：
国别省市：
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