评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用，该试剂盒包括用于特异性检测RFFL表达水平或表达模式的试剂。应用本发明专利技术的技术方案，通过应用本试剂盒对肝癌患者的组织标本中RFFL的表达情况进行检测可以有效地对肝癌患者的生存预后情况进行准确评估。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用，该试剂盒包括用于特异性检测RFFL表达水平或表达模式的试剂。应用本专利技术的技术方案，通过应用本试剂盒对肝癌患者的组织标本中RFFL的表达情况进行检测可以有效地对肝癌患者的生存预后情况进行准确评估。【专利说明】评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用
本专利技术涉及生物医药
，具体而言，涉及一种评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用。
技术介绍
肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是全球最常见的恶性肿瘤之一,发病率居恶性肿瘤第五位，为第二大肿瘤死因。而据统计我国肝癌死亡人数约占全球因肝癌死亡人数的50%。目前以肝切除术为代表的外科治疗仍然是肝癌的首选治疗方法，但术后5年的复发转移率达60%，甚至更高。随着肝脏外科技术、麻醉和围手术期处理水平的不断改善，使肝癌手术切除率得到了显著的提高，肝癌手术死亡率也不断下降。尽管如此，肝癌患者的整体治疗水平仍无显著改善，其关键原因是肝癌切除术后复发转移率仍居高不下。肝癌的预后是指预见患有肝癌的患者的各种情况，例如从肝癌中全面康复的可能性，经治疗后复发的可能性，肝癌诊断后患者生存的可能性等等。这可以根据疾病的严重性、诊断时间、治疗进展等各种情况而变化。只有根据其预后适当地应用各种治疗方法时，肝癌才能够得到有效的治疗。例如，对于被评估为有良好的预后的患者，有必要避免可能对患者引起严重副作用的危险的治疗方法，例如激进的化疗或手术、放疗等，而选择那些相对温和、保守和安全的治疗方法。另一方面，对于被评估为有较差的预后的患者，应当积极地进行化疗或手术，例如放疗等治疗方法以力图增加生存期或生存率。 根据迄今为止进行的研究，已经发展的肝癌的预后非常糟糕，显示了自诊断起6个月内死亡的高致死率，剩余仅四个月的平均寿命长度。但是，大小小于3厘米的肝癌有良好的预后，且已知无需任何特别治疗，一年的生存率为90%,且手术后5年的生存率为约40~50%。然而，根据现有技术很难精确地评估肝癌患者的预后。为了精确评估预后，需要一种把患者划分为各风险组群的分析方法。然而，迄今为止，仅仅依靠在诊断和初次手术治疗时的临床病理肝癌阶段来确定预后，而没有一种用于精确评估肝癌的方法。因此，深入研究探讨肝癌复发转移相关的分子标志物，不仅为肝癌患者的治疗和预后评估带来益处，也可为开发新的靶向治疗药物提供依据。因此，寻找评估肝癌预后的新的分子标志物，具有重要的理论和现实意义。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种评估肝细胞癌预后的试剂盒及RFFL的应用，以解决现有技术中对肝细胞癌预后评估缺少有效的生物学分子标志物的技术问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种评估肝细胞癌预后的试剂盒。该试剂盒包括用于特异性检测RFFL表达水平或表达模式的试剂。进一步地，试剂包括用于特异性检测RFFL mRNA表达水平或表达模式的RT-PCR引物。进一步地，RT-PCR引物的序列为 SEQ ID NO:1 和 SEQ ID NO:2。进一步地，试剂用于特异性检测RFFL所编码的蛋白的表达水平或表达模式。进一步地，试剂包括:用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。进一步地，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂包括二甲苯、乙醇及蒸馏水。进一步地，用于脱水、透明和封片的试剂包括乙醇、二甲苯及显微镜封片用中性树脂。根据本专利技术的另一个方面，提供一种RFFL作为分子标志物在制备评估肝细胞癌预后的试剂盒中的应用。进一步地，试剂盒包括用于肝癌组织标本石蜡包埋和切片的试剂，用于肝癌组织标本石蜡切片的脱蜡和水化的试剂，用于抗原修复的柠檬酸抗原修复液，用于灭活内源性过氧化物酶的双氧水，用于封闭的封闭血清，山羊抗人RFFL蛋白多克隆抗体、辣根酶标记的兔抗山羊IgG抗体，用于显色的DAB显色剂和苏木素，以及用于脱水、透明和封片的试剂。根据本专利技术的再一个方面，提供一种RFFL作为分子标志物在体外评估肝细胞癌预后中的应用。应用本专利技术的技术方案，通过应用本试剂盒对肝癌患者的组织标本中RFFL的表达情况进行检测可以有效地对肝癌患者的生存预后情况进行准确评估。【专利附图】【附图说明】 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中: 图1示出了 RFFL mRNA和蛋白在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达水平: 图2示出了 RFFL蛋白在肝癌组织中的表达水平； 图3示出了 RFFL高表达与肝癌患者差的生存结局的相关；以及 图4示出了本专利技术在实施中例I中的应用情况及其效果。【具体实施方式】需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本专利技术。RFFL (E3 ubi quit in-protein ligase rif ifylin)基因定位 17ql2 染色体,编码的蛋白含有363个氨基酸，大小为40KDa。截至目前，未发现有RFFL在肝癌中的作用的研究报道。 本专利技术的专利技术人首先采用Real-time qPCR、RT-PCR和Western-blot技术在新鲜肝癌组织及其邻近非瘤肝组织中检测RFFL的表达情况。结果发现，RFFL在肝癌组织中的表达水平明显高于其邻近非瘤肝组织。同时专利技术人还采用Real-time qPCR和Western_blot技术检测RFFL在正常肝细胞系L02及其它4种肝癌细胞系(H印G2、MHCC97-L、MHCC97-H和HCCLM3)中的表达情况。结果发现，RFFL在4种肝癌细胞系中的表达水平也明显高于正常肝细胞系。专利技术人进一步采用免疫组织化学方法，对70例原发性肝细胞癌患者组织标本中RFFL的表达进行了检测，并分析了 RFFL表达水平与肝癌临床病理特征的相关性。结果发现，RFFL蛋白在肝癌组织中的阳性表达率和表达水平均明显高于其邻近非瘤肝组织。为了探讨RFFL的表达与肝癌患者生存预后之间的关系，专利技术人对前述的70例肝癌患者进行了临床随访研究，获得了肝癌患者手术后的生存时间及复发转移的资料。根据RFFL的免疫组化Michio Shimizu评分的结果，将70例肝癌标本分为RFFL高表达组(阳性表达组)和RFFL低表达组(阴性表达组)。采用Kaplan-Meier生存曲线法计算分析RFFL高表达组和低表达组患者手术后的生存情况，并以Log-rank法分别比较和检验两组之间总体生存率和无瘤生存率的差异。结果显示，RFFL高表达组肝癌患者的总体生存率和无瘤生存率均明显低于RFFL低表达组。接着专利技术人运用Cox比例风险回归模型对与肝癌预后相关的临床病理参数进行分析。发现不管单因素回归还是多因素回归分析都显示RFFL高表达代表着更差的总体生存时间和无瘤生存时间，RFFL高表达是影响肝癌患者预后本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评估肝细胞癌预后的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于特异性检测RFFL表达水平或表达模式的试剂。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：徐江锋，刘细玉，
申请(专利权)人：浙江大学医学院附属义乌医院，
类型：发明
国别省市：