本发明专利技术提供了一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，取实验动物，在超声设备引导下肝脏原位接种肿瘤细胞，动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况。本发明专利技术具有如下优点：制作过程简单易行，成功率高，能广泛推广应用；制作的动物模型能真实地模拟临床肝癌转移的病理过程；制作的动物模型能动态反映肝癌细胞上皮间质样变发生过程。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及构建一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型， 本专利技术也可成为针对肝癌细胞上皮间质样变过程的靶向抗肿瘤药物研发的理想验证平台。
技术介绍
原发性肝癌是高度恶性的肿瘤之一，其死亡率位于我国恶性肿瘤的第二位。绝大多数肝癌病人死亡与肝癌复发、转移相关。研究表明肝癌复发、转移是多基因参与、多步骤完成复杂过程，包括肿瘤细胞粘附、迁移和肿瘤细胞对细胞外基质的降解等，目前，其发生的分子机制尚不完全清楚，进一步探索研究肝癌复发、转移分子机制，对设计靶向药物、改善肝癌患者预后及提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义。近年来肿瘤细胞转移过程中常出现上皮细胞间质样转变(EMT)受到关注。上皮细胞间质样转变是指具有极性的上皮细胞转换成为活动能力的间质细胞并获得侵袭和迁移能力的过程，在动物胚胎发育过程中普遍存在。当前认为90%以上的上皮细胞恶性肿瘤在发生侵袭与转移过程中发生上皮细胞间质样转变，例如乳腺癌、结肠癌、胰腺癌、肺癌、前列腺、肝癌等。上皮细胞间质样转变以上皮细胞标记缺失，如上皮型钙粘素(E-cadherin)、β 连环蛋白(β-catenin)和角质蛋白18 (cytokeratin 18)等及间叶组织标记的获得，如波形蛋白(Vimentin)，神经型钙粘素(N-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(α -SMA)等为重要特征，涉及到多个信号转导通路和复杂的分子机制，具体包括细胞粘附分子的表达减少；角蛋白为主的细胞骨架转变为波形蛋白为主的细胞骨架，从而引起细胞形态的改变。这种表型的转换使得肿瘤细胞容易摆脱细胞-细胞间黏附，并具有更强的穿透和游走能力， 因此上皮间质样改变与肿瘤细胞的侵袭、转移关系密切。研究肿瘤上皮间质样改变的发生过程和调控机制，针对上皮间质样改变发生过程设计靶向药物对于恶性肿瘤的干预及治疗具有重要意义。上皮间质样改变与原发性肝癌侵袭和转移的关系及其分子机制已成为目前肝癌研究的热点。这些研究常包括上皮间质样改变相关基因表达的改变引起肝癌细胞形态改变的体外研究，然后通过裸鼠接种体内验证上皮间质样改变相关基因的表达改变，最后在临床肝癌标本中证实上皮间质样变的现象。目前应用较为广泛的用于研究上皮间质样改变的动物模型是肝癌细胞皮下接种法，这种方法虽然简单易行，但与肝癌复发转移的临床生理、 病理相差甚远，因此不能真实反映肝癌转移中上皮间质样改变的作用。近年来，研究者尝试用经腹盲目穿刺原位接种法制造动物模型，但这种方法具有穿刺成功率低，容易出血，腹腔播散较多等缺点。而且现有的动物模型只反映肝癌侵袭转移过程中某一时点的上皮间质样改变现象，与上皮间质样改变是一个动态的过程相违背，因此这些研究不能确切反映上皮间质样改变与肝癌侵袭转移的关系。构建能符合肝癌转移临床特点、体现上皮间质样改变动态发生过程的肝癌原位动物模型是获得可靠结果的前提和基础。然而，目前尚缺乏这样的动物模型。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决肿瘤细胞侵袭转移过程中发生的上皮间质样改变难以观察的问题，开发一种简单易行、能广泛推广应用的、成功率高的、可真实模拟肝癌临床的原位移植瘤上皮间质样变动态发生过程的一种动物模型构建的方法。为了达到上述目的，本专利技术提供了一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，取实验动物，在超声设备引导下肝脏原位接种肿瘤细胞，动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况。所述的实验动物为BALB/c裸鼠。所述的超声设备为配备有高频(5-12MHZ)探头的彩色多普勒超声设备。所述的肝脏原位接种肿瘤细胞的方法为肝实质注射肝癌细胞。所述的动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况的方法为接种后第一周开始，每隔一周处死动物，直到接种后第六周；将处死的动物解剖、取出肝脏及肺脏，脱水包埋成蜡块；将肝脏切片，免疫组织化学染色检测不同时期肝癌组织及癌旁组织中上皮间质样变相关指标变化，将肺脏连续切片，计数肺转移率和转移病灶数。所述的免疫组织化学染色方法为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法(SP 法)。所述的上皮间质样变相关指标为上皮型钙粘素(E-cadherin)、神经型钙粘素 (N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin), α平滑肌肌动蛋白(α -SMA)和Snail蛋白中的一种或几种。所述的肺转移灶计数方法为肺连续切片，经苏木精-伊红染色(HE)，显微镜下观察计数肺转移率和病灶转移数。本专利技术采用在高频彩色多普勒引导下将肿瘤细胞注入肝实质，隔周处死实验动物，原位移植肿瘤、癌旁组织及肺包埋蜡块切片，通过对上皮间质样变的相关指标进行免疫组织化学染色和肺连续切片来观察肝细胞癌经历上皮向间质样细胞转变的动态过程及转移情况，该模型可为研究肝癌细胞上皮间质样改变机制和验证新的抗上皮间质样改变靶向治疗提供平台。本专利技术具有如下优点(1)制作过程简单易行，成功率高，能广泛推广应用；(2)制作的动物模型能真实地模拟临床肝癌转移的病理过程；(3)制作的动物模型能动态反映肝癌细胞上皮间质样改变发生过程。附图说明图1为接种后第一周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图2为接种后第二周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图3为接种后第三周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图4为接种后第四周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图5为接种后第五周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图6为接种后第六周肝癌及癌旁组织上皮型钙粘素、Snail和α平滑肌肌动蛋白表达图。具体实施例方式下面结合实施例来具体说明本专利技术。实施例1(1)取BALB/c裸鼠(4-6周，雄性)作为实验动物，每组5只裸鼠，用1.5% (1.5克溶于 IOOml双蒸水中)戊巴比妥钠(40mg/kg，国药集团产品，货号B1202)腹腔注射麻醉；(2)将Matrigel基质膜(BD公司产品，货号3M234)和无血清高糖DMEM(GIBIC0公司产品，货号11995081)按体积比1 :1混合，分别用上述混合溶液将8X IO6个对数生长期肝癌细胞HCCIiO-control (HCCLM3细胞转染慢病毒空载体，HCCLM3细胞为复旦大学肝癌研究所构建、保存及公开使用；慢病毒空载体为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号 GC080357)、shRNA-CD151-HCCLM3 (HCCLM3 细胞转染干扰 CD151 表达质粒的慢病毒，HCCLM3 细胞复旦大学肝癌研究所构建、保存及公开使用；干扰CD151表达质粒的慢病毒为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号GC080357)、shRNA- α 6-HCCLM3 (HCCLM3细胞转染干扰整合素α 6表达质粒的慢病毒，HCCLM3细胞复旦大学肝癌研究所构建、保存及公开使用，干扰整合素α 6表达质粒的慢病毒为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号GC92064)、 H印G2-control(H印G2细胞转染慢病毒空载体，IfepG2细胞为ATCC产品，货号HB8065，慢病毒空载体为上海吉凯基因化学技术有限公司产品，货号GC080357)和H印G2-CD151 (HepG2 细胞转染以本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，取实验动物，在超声设备引导下肝脏原位接种肿瘤细胞，动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况。
【技术特征摘要】
1.一种用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于， 取实验动物，在超声设备引导下肝脏原位接种肿瘤细胞，动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况。2.如权利要求1所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的实验动物为BALB/c裸鼠或非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠。3.如权利要求1所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的超声设备为配备有高频探头的彩色多普勒超声设备。4.如权利要求1所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的肝脏原位接种肿瘤细胞的方法为肝实质注射肝癌细胞。5.如权利要求1所述的用于研究肝细胞肝癌上皮间质样变动态过程的动物模型的方法，其特征在于，所述的动态观察上皮间质样变相关指标变化以及肺转移情况的方法为接...
【专利技术属性】
技术研发人员：樊嘉，周俭，柯爱武，施国明，黄晓勇，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：31
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