胰岛的分离方法及用于保护胰岛组织的保护液技术

本发明专利技术涉及一种胰岛的分离方法及能够用于该方法的保护液，所述胰岛的分离方法包括下述工序：在摘出的胰脏的胰管内注入保存液的注入工序；将上述胰脏浸渍在浸渍液中进行保存的保存工序；破坏上述胰脏得到胰组织的消化工序；和将上述胰组织浸渍在纯化溶液中得到胰岛的纯化工序，其特征在于，上述消化工序包括：将含有消化酶的酶溶液注入上述胰脏的内部的酶注入步骤；使上述消化酶活化的消化开始步骤；使上述消化酶失活的消化停止步骤；和将已被破坏的胰组织回收的回收步骤，通过在上述消化开始步骤之前向体系中添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，从而在开始上述消化开始步骤的时刻，使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂存在于上述胰脏的内部，通过使用上述胰岛的分离方法及能够用于该方法的保护液，能够以高产量得到适合移植的形状及大小的胰岛。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从胰脏分离能够移植的胰岛的方法及在该分离方法中用于保护胰岛组织的保护液。
技术介绍
I型糖尿病的根治方法例如有从脑死亡者移植胰脏本身的胰脏移植。所述胰脏移植仅通过I次移植就能脱离胰岛素等，效果好。但是，外科手术复杂、而且伴随血液循环再建，也可能引起并发症，因此存在对患者身体造成很大负担的问题。因此，近年来，胰岛移植作为新的糖尿病根治方法受到关注。所谓胰岛移植，是将作为调节血糖的激素的胰岛素或胰高血糖素的分泌组织即胰岛从胰脏分离，将分离的胰岛从门静脉向肝脏移植的方法。被 移植的胰岛成活在肝脏内的门静脉末端，由此分泌胰岛素。现有的胰脏移植为伴有高侵袭性的外科处置，与此相对，该胰岛移植是在门静脉留置导管，按照静脉滴注的要领移植胰岛进行处置即可，因此与胰脏移植相比，患者身体的负担较轻并且安全。另外，胰岛移植与其他脏器移植不同，其为细胞移植的一种，因此能够将胰岛半永久地冷冻保存。进而，胰岛移植时还存在下述优点即使发生排斥反应，由于移植的胰岛本身被吸收，所以也无需更换摘除细胞。另一方面，胰岛移植存在下述缺点，S卩，由于从胰脏仅分离胰岛细胞在技术上的困难性，所以不能获得适合移植的充分产量的胰岛。结果，需要多次的移植才能实现胰岛素脱离，需要接受来自平均2. 6人的供体的胰脏提供。因此，如何能够从胰脏更多地获得质量优异的胰岛成为课题。为了解决该课题，一直以来研究了各种胰岛分离方法。例如，专利文献I中公开了特征在于将含有蛋白酶抑制剂的保护液预先注入胰管内的胰岛的分离方法。该胰岛的分离方法中的蛋白酶抑制剂用于提高胰岛的产量。在现有的胰岛分离方法中，不能得到质量及产量充分的胰岛的原因如非专利文献I所公开的那样，是因为存在于胰脏内的来自胰外分泌腺的内源酶由于胰脏的摘出而被活化，损伤胰脏组织，之前的胰岛分离方法通过采取抑制内源酶活性的手段，以求改善胰岛的质量及产量。来自胰外分泌腺的酶有胰蛋白酶、来自胰的弹性蛋白酶、糜蛋白酶等，上述专利文献I中使用特异性抑制胰蛋白酶的乌司他丁。专利文献I中指出，作为通过蛋白酶抑制剂适当地保护胰岛的组织的结果，胰岛的产量增大。但是，现有的方法在分离的过程中胰岛细胞被撕裂等、通常受到物理损伤，不能以必要的产量稳定地获得在移植后分泌充分的胰岛素的大小和形状的胰岛。另外，专利文献I中，用作蛋白酶抑制剂的乌司他丁是以人尿作为原料的生物来源制剂，也存在对于生物体的风险高、缺乏安全性的问题。专利文献I :国际公开第2006/068226号非专利文献I Transplantation Proceedings, 2003, Vol. 35, no. 7,2455-
技术实现思路
因此，本专利技术的目的在于提供一种胰岛的分离方法及用于保护胰岛组织的保护液，所述胰岛的分离方法能够以高产量获得适合移植的形状及大小的胰岛。本专利技术人等在进行本专利技术时，新发现了若供体的嗜中性粒细胞事先浸润在摘出后的胰脏内，经过消化的工序,则其数量增加,并且从该嗜中性粒细胞释放的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶对胰岛造成损伤。因此，专利技术人等着眼于通过抑制所述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的作用能有效地遏制胰岛的损伤，从而完成了本专利技术。本专利技术涉及以下内容。 一种胰岛的分离方法，包括下述工序将摘出的胰脏破坏得到胰组织的消化工序；和 将上述胰组织浸溃在纯化溶液中得到胰岛的纯化工序，其特征在于，上述消化工序包括下述步骤将含有消化酶的酶溶液注入上述胰脏的内部的酶注入步骤；使上述消化酶活化的消化开始步骤；使上述消化酶失活的消化停止步骤；和将已被破坏的胰组织回收的回收步骤，通过在上述消化开始步骤之前添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂，从而在开始上述消化开始步骤的时刻，使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂存在于上述胰脏的内部。如所述的胰岛的分离方法，其特征在于，在上述消化工序之前，还包括向摘出的胰脏的胰管内注入保存液的注入工序及/或将上述胰脏浸溃在浸溃液中进行保存的保存工序。如或所述的胰岛的分离方法，其特征在于，上述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的添加通过向上述酶溶液中添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂来进行。如或所述的胰岛的分离方法，其特征在于，上述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的添加通过向上述酶溶液及上述纯化溶液中添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂来进行。如所述的胰岛的分离方法，其特征在于，上述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的添加通过向上述保存液、上述浸溃液、上述酶溶液及上述纯化溶液的各个溶液中均添加嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂来进行。如 中任一项所述的胰岛的分离方法，其特征在于，上述保存液、上述浸溃液、上述酶溶液及上述纯化溶液中的上述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的浓度为2 200 μ Μ。 一种保护液，用于保护上述胰组织免受由浸润在胰组织中的嗜中性粒细胞所释放出的弹性蛋白酶的作用，其特征在于，含有嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂。如所述的保护液，其特征在于，上述保护液中的上述嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的浓度为2 200 μ M0此处，所谓保护液是指本专利技术的胰岛分离方法中使用的保存液、浸溃液、酶溶液或纯化溶液等中添加了嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂而得到的液体。根据本专利技术，在胰岛的分离方法中，能够以高产量得到适合移植的形状及大小的胰岛。附图说明(a) (d)为表示嗜中性粒细胞向胰脏的浸润程度的图。为表示胰岛分离的各工序中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活性的图。为表示嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂的最佳浓度的图。为表示实施例及比较例中所示的胰岛分离方法的各工序中的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶的活性的图。为表示所得的胰岛的IEQ(IsletEquivalent)的图。 为表示所得的胰岛的分离指数(IsolationIndex)的图。为表示所得的胰岛的纯度的图。为表示所得的胰岛的长径分布的图。(a) ⑷为所得胰岛的电子显微镜照片。为表示所得胰岛的刺激指数(StimulationIndex)的图。具体实施例方式以下，说明本专利技术的胰岛分离方法。本专利技术的胰岛分离方法包括⑴向胰管内注入保存液的“注入工序”；⑵使胰脏浸溃在浸溃液中进行保存的“保存工序”；(3)破坏胰脏的“消化工序”；(4)从破坏而得到的胰组织纯化胰岛的“纯化工序”。并且，消化工序包括以下操作步骤将酶溶液注入胰脏的胰管内使其膨胀的“酶注入步骤”；开始消化使胰脏破坏的“消化开始步骤”;停止胰组织的进一步消化的步骤“消化停止步骤”;和将已被破坏的胰组织回收，任意地清洗及浓缩的“回收步骤”。上述步骤中，本专利技术的特征在于，至少在消化开始步骤的操作开始的时刻，使嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂存在于膜脏内部。接下来，说明本专利技术的胰岛分离方法中的各工序。(I)注入工序作为胰岛分离方法的最初工序，将保存液注入胰管内。保存液的注入例如可以通过在胰管中插入导管来进行。此时，可以利用泵调节注入压。插入的导管的数量优选为I根。通过为I根，能够减少注入胰管内的溶液的漏液，也能将脏器的损伤控制在最小限。保存液的渗透压为270 450m0sm/l，优选为300 400m0sm/l。渗透压在上述范围内时，在将保存液注入胰管内后，能够防止保存中胰组织膨胀或收缩。另外，为了防止细胞或组织的酸性分解等，保存液的PH优选为7 8左右。注入胰管的保存液中含有脏器保存液。作为脏器保存液，可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：种村匡弘，泽芳树，名井阳，伊藤寿记，森正树，土岐祐一郎，
申请(专利权)人：株式会社大塚制药工场，
类型：
国别省市：