本发明专利技术公开了一种重组人胰岛素及其编码基因与应用。该重组人胰岛素，是如下所述的蛋白质：（ａ）由序列表中序列１的氨基酸残基序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列表中序列１的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有人胰岛素功能的由（ａ）衍生的蛋白质。本发明专利技术的重组人胰岛素在天然人胰岛素的Ａ，Ｂ链序列之间引入连接肽利于形成β转角结构，重组蛋白模拟的空间结构与天然胰岛素结构非常相似，具有胰岛素活性。本发明专利技术的含有重组人胰岛素基因的乳酸菌工程菌能在肠道内存活４８小时以上，刺激ＮＯＤ小鼠免疫系统产生重组人胰岛素特异性抗体，使与免疫耐受相关的细胞因子ＩＬ－４水平明显升高，诱导免疫耐受产生。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种重组人胰岛素及其编码基因与应用，特别涉及一种重组人胰岛 素及其编码基因与其在制备治疗I型糖尿病的乳酸菌口服疫苗中的应用。
技术介绍
胰岛素(Insulin, INS)是一种重要的内分泌激素，是引起自身免疫疾病I型 糖尿病(T1DM)的主要自身抗原。现阶段T1DM并无有效的预防手段，且发病者只能 通过一 日三次注射胰岛素来保持血糖稳定。有研究表明通过给T1DM的模型非肥胖糖尿病(Non-obese diabetic, NOD)小 鼠口服胰岛素能减轻或延缓其发病过程，其机制是抗原通过黏膜的Peyer' s区吸 收，从而激活免疫系统，之后与耐受性相关的效应T细胞被激活，引发口服耐受性， 从而保护胰岛素不被损伤(Weiner HL Oral tolerance: immune mechanisms and the generation of Th3-type TGF-beta-secreting regulatory cells. Microbes and Infection, 2001, 3: 947-954)。但是如果直接口服抗原，因为蛋白质在胃肠道里 的降解，会明显影响抗原的生物利用率。而乳酸菌是一类被普遍认为安全的生物体, 在食品行业中已得到广泛的应用，可以作为一种合适的表达胰岛素的基因工程载体。 而现在胰岛素的生产是通过基因工程大量表达，纯化，溴化氰裂解，变性，复性等 多个步骤，工艺繁琐。因此有必要采用新方法进行给药。 .
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种重组人胰岛素及其编码基因与应用。 本专利技术所提供的重组人胰岛素，名称为R-INS，是如下(a)或(b)的蛋白质:(a) 由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b) 将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基 的取代和/或缺失和/或添加且具有人胰岛素功能的由(a)衍生的蛋白质。其中，序列表中的序列1由59个氨基酸残基组成。为了使(a)中的R-INS分泌到细胞周质或培养基中或使其功能稳定，可在由序 列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的N端连接上信号肽序列，为 了 (a)中的R-INS便于纯化，可在由序列表中序列l的氨基酸残基序列组成的 蛋白质的N端或C端连接上如表l所示的标签。表l标签的序列<table>table see original document page 4</column></row><table>上述(b)中的R-INS可人工合成，也可先合成其编码基因，再按照下述方法进 行生物表达得到。上述(b)中的R-INS的编码基因可通过将序列表中SEQIDNa: 2 的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的 错义突变，和/或在其5'端连上信号肽的编码序列，和/或在其5'端和/或3'端连上 表1所示的标签的编码序列得到。上述重组人胰岛素的编码基因(y -/7V50也属于本专利技术的保护范围。 鉴于密码子的兼并性和乳酸菌对氨基酸密码子的偏向性，本专利技术设计合成了含 乳酸菌偏爱密码子的重组人胰岛素的编码基因，可使重组人胰岛素基因的在乳酸菌 中表达。所述重组人胰岛素的编码基因，是优化的重组人胰岛素基因，具体可为如下l)、 2)或3)的基因1) 序列表中SEQ ID N2: 2的自5'端第卜177位核苷酸序列；2) 编码序列表中SEQ ID Na: l蛋白质序列的多核苷酸；3) 在严格条件下与序列表中SEQ ID NS: 2限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。 所述严格条件可为在O. 1XSSPE (或0. IXSSC)， 0. 1。/。SDS的溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。序列表中序列2是由180个脱氧核苷酸组成，自5'端第1-177位核苷酸序列为 编码序列，编码具有序列表中序列1的氨基酸残基序列，自5'端第178-180位核苷 酸序列为终止密码子。含有上述重组人胰岛素基因的重组表达载体和转基因细胞系也属于本专利技术的保 护范围。含有上述重组人胰岛素基因的工程菌也属于本专利技术的保护范围。 所述工程菌是将上述的重组人胰岛素的编码基因通过原核表达载体转入到 乳酸菌中，筛选得到的可表达上述重组人胰岛素工程菌。所述重组人胰岛素的编码基因的5'端还连接有方便编码的蛋白在所述工 程菌的细胞壁中表达的信号肽基因。所述乳酸菌为干酪乳杆菌(7acto&cj7J〃s case。 ATCC 27092或乳酸乳球 菌(73c"cocciA 7ac"50 MG1363，优选为干酷乳杆菌(Ja"o/A3"7JiAS casei) ATCC 27092。所述信号肽基因为SPu^信号肽基因；所述表达的权利要求1所述重组人 胰岛素以权利要求l所述重组人胰岛素和SPu一信号肽的融合蛋白的形式在所述 工程菌的细胞壁中表达；所述SPu一信号肽基因的核苷酸序列是GENBANK号为 M60178的自5'端第101—214位核苷酸序列；所述信号肽基因的5'端还连接 有组成型表达启动子。所述原核表达载体优选为pSW501 。含有上述工程菌的药物也属于本专利技术的保护范围。所述药物可为预防和\或治疗糖尿病，特别是预防和\或治疗I型糖尿病的 菌剂。所述药物可作为治疗I型糖尿病的口服疫苗，服用剂量可为KT-lO^cfu/ 次/60kg，每周一次。本专利技术的重组人胰岛素基因，通过密码子优化，可在乳酸菌中表，终重组人胰岛 素。本专利技术的重组人胰岛素在天然人胰岛素的A，B链序列之间引入连接肽(RRSPNGKR)利于形成(5转角结构，重组蛋白模拟的空间结构与天然胰岛素结构非常相似，实验证 明该蛋白具有胰岛素活性，可以与胰岛素多克隆抗体特异性结合。 .实验证明，本专利技术的含有重组人胰岛素基因的工程菌能在肠道内存活48小时以 上，刺激NOD小鼠免疫系统产生重组人胰岛素特异性抗体，使与免疫耐受相关的细 胞因子IL-4水平明显升高，诱导免疫耐受产生。表明，本专利技术的含有重组人胰岛素 基因的工程菌，对于非肥胖糖尿病的治疗具有很好的效果。本专利技术的工程菌制成菌剂作为治疗非肥胖糖尿病的口服疫苗，没有繁琐的后加 工过程，只需经过简单的离心或其它常规加工即可得到，具有良好的应用前景。 附图说明图1为人胰岛素基因和改造的重组人胰岛素基因序列分析图2为重组人胰岛素基因乳酸菌表达载体pSW501和对照载体pSW509的构建示意3为工程菌MG1363-pSW501、 ATCC27092-pSW501表达胰岛素的Western-blot图图4为工程菌MG1363-pSW501、 ATCC27092-pSW501表达胰岛素浓度筛选的 Western-blot5为NOD小鼠血清中SPUsp45-R-INS特异性抗体的分析结果图6为NOD小鼠血清中IL-4水平检测结果具体实施方式下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中，所述百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。实施例1、重组人胰岛素基因及表达其的工程菌的获得1、重组人胰岛素基因的合成根据乳酸菌偏爱密码子在人胰岛素基因序列中替换37个碱基对，并在其A， B 链序列之间加入连接肽(RRSPNGKR)的编码序列5' -CGTAGATCTCCTAA本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组人胰岛素，是如下（ａ）或（ｂ）的蛋白质：（ａ）由序列表中序列１的氨基酸残基序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列表中序列１的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有人胰岛素功能的由（ａ）衍生的蛋白质。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钟瑾，陈思维，还连栋，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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