用于培养脂肪细胞的方法技术

本发明专利技术涉及用于培养脂肪细胞的方法，其中分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞的同质群培养于三维培养基质上。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及，涉及脂肪细胞培养物，及其用于筛选调节脂肪细胞代谢的化合物的用途。
技术介绍
与白色脂肪组织肥大有关的肥胖的患病率，在普通公众当中持续增加。因此，在法国从1997年至2003年之间，超重或肥胖的个体的比例已经从36. 7%增加到41. 6%;此外，2009年法国的肥胖患病率(定义为大于30kg/m2的身体质量指数(BMI (法文原文为MC)))为14. 5%。此外，肥胖是许多病理疾病(包括特别是心血管事件)的风险因素，这使得其治疗性治疗显得更为迫切。 然而，对抗这一流行病的主要方式仍是改善肥胖个体的饮食和增加体育锻炼，还探索了其它方法，尤其是外科和基于药物的方法。目前基于药物的方法主要目的在于减少能量摄入，例如通过限制脂质的肠吸收(奥利司他)，或者通过促进饱腹的感觉(西布曲明)，或通过减少食品摄入相关的快感(利莫那班)的降低食欲。然而，这些方法的效果有限或者有副作用一因此还有报道，利莫那班可导致严重的抑郁症一尤其已经导致西布曲明和利莫那班从市场上的召回，使得治疗选择非常有限，并且使得有必要探索其它方法，使得有可能例如调节脂肪细胞的代谢以便限制脂质存储，或反之，促进其利用。然而，由于缺乏真正代表人类体内情况的用于研究脂肪细胞代谢的体外或动物模型，后一种方法难以处理。事实上，至于体外模型，形成白色脂肪组织的成熟脂肪细胞(特别是特征在于存在单一脂质液泡)尤其脆弱，并且事实上这些细胞通常在48小时之内在培养中失去它们的代谢和分泌特性。因此，为克服这些困难，提出了一些培养系统。然而，除了脂肪细胞以外，这些培养物包括附属细胞类型，如前脂肪细胞或内皮细胞(Sonda等人，(2008)Endocrinology149:4794-4798)、或者通常采用从干细胞体外分化的脂肪细胞进行制备(Choi等人，(2010)Tissue Engineering:Part C，Kang et al. (2007)Biomaterials 28:450-458)、或者来自前脂肪细胞(Daya 等人，(2007)Differentiation 75 :360-370, W02007/113591、Stacey 等人，(2009)Tissue Engineering:Part A15:3389-3399),其表型和分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞差距相对较远(参见图I至图3)。因此，这些系统显得不能特异性地且直接地代表分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞的代谢。因此，本专利技术的一个目的在于提供这样的培养系统，其接近生理情况，特别是接近人体生理。
技术实现思路
本专利技术来自由本专利技术人所提供的意想不到的展示，即在没有其它细胞类型的情况下，使用三维培养基质可以培养分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞，以及这样培养的脂肪细胞至少保持48h，表型和新鲜分离的成熟脂肪细胞相似。因此，本专利技术涉及，其中在三维培养基质上培养分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞的同质群。本专利技术还涉及脂肪细胞培养物，其包括接触三维培养基质的分离自脂肪组织的成熟脂肪细胞的单培养物。本专利技术还涉及根据本专利技术的脂肪细胞培养物用于筛选调节脂肪细胞代谢的化合物的用途。·本专利技术还涉及一种用于筛选调节脂肪细胞代谢的化合物的方法，其中-使要筛选的化合物接触根据本专利技术的脂肪细胞培养物；-确定与未接触要筛选的化合物的根据本专利技术的脂肪细胞培养物相比，是否脂肪细胞代谢的至少一个代表性参数发生了改变；-如果化合物改变了脂肪细胞代谢的至少一个代表性参数，那么选择该化合物。专利技术详述如此处所意图的，表述“成熟脂肪细胞”表示分化的脂肪细胞。本领域技术人员可以容易地鉴定成熟脂肪细胞。特别是，根据本专利技术的成熟脂肪细胞通常具有单一脂质液泡、脂解活性，特别是被β -肾上腺素能制剂(如肾上腺素和去甲肾上腺素)所诱导的、并且还对胰岛素敏感，尤其定义为胰岛素诱导的葡萄糖和脂肪酸从细胞外介质到细胞内介质的转运，所述转运尤其和，成熟脂肪细胞的质膜内，分别为GLUT-4和⑶36转运蛋白的胰岛素依赖性易位有关。根据本专利技术的成熟脂肪细胞尤其不同于前脂肪细胞，尤其是在本领域技术人员公知的前脂肪细胞特异性标志物DelKl/Prefl的表达方面(其可以通过实时PCR测量)，在根据本专利技术的成熟脂肪细胞中基本上不存在。根据本专利技术的成熟脂肪细胞分离自脂肪组织。因此，根据本专利技术的成熟脂肪细胞，尤其不来自脂肪细胞的前体(如前脂肪细胞或全能、多能或多潜能干细胞)的体外分化。至于根据本专利技术的脂肪组织，它可以来自任何动物物种。然而，优选根据本专利技术的脂肪组织取自一个或多个人类个体。可以通过本领域技术人员公知的众多方法从脂肪组织分离成熟脂肪细胞，尤其是利用成熟脂肪细胞的低密度。特别是，可以用胶原酶处理脂肪组织，然后，消化之后，通过织造的棉纱布过滤；使滤出物在水介质中沉积，通过收获悬浮的细胞可以回收根据本专利技术的成熟脂肪细胞的同质群。如此处所意图的，“成熟脂肪细胞的同质群”特别是这样的，其基本上不含其它细胞类型，特别是内皮细胞或前脂肪细胞。特别是，根据本专利技术的成熟脂肪细胞的同质群包括小于10%、更特别是小于5%的成熟脂肪细胞以外的细胞，特别是前脂肪细胞。例如，可以通过定量表达前脂肪细胞特异性标志物(如DelKl/Prefl)的细胞的数目来确定成熟脂肪细胞的同质群中前脂肪细胞的量。如此处所意图的，“成熟脂肪细胞的单培养物”是成熟脂肪细胞的同质群的培养物。当其被孵育时，成熟脂肪细胞的同质群被说成是“培养的”或“在培养中”，即在允许构成群的细胞生存的条件下，保持在体外。这种条件还有适当的培养介质是本领域技术人员公知的。这些培养介质是这样的，其包含能够保证构成群的细胞生存至少12小时、优选至少24小时、更优选至少48小时的所有元素，特别是营养元素。通过举例的方式，群可以孵育于DMEM/F12、1%青霉素-链霉素、50nM胰岛素介质中，在搅拌下，在37°C下，在5%CO2氛围中，介质定期更新。有利的是，用于根据本专利技术的成熟脂肪细胞的培养介质可以例如包括旨在调节成熟脂肪细胞代谢活性的化合物，如毛喉素和地塞米松。此外，成熟脂肪细胞的群的培养优选进行至少3小时、6小时、12小时、24小时或48小时。根据本专利技术的，当脂肪细胞接触基质时，即当它们铺于基质上时，或当它们附着在基质上时，成熟脂肪细胞“培养于三维培养基质上”。在一个具体的实施方式中，根据本专利技术的，包括以下步骤-使脂肪细胞的同质群接触三维培养基质； -孵育接触培养基质的成熟脂肪细胞，特别是在允许细胞存活特别是至少存活48小时的条件下。根据本专利技术，“三维培养基质”由材料，特别是适合用于获得三维细胞培养物的生物相容材料组成；换言之，三维培养基质是合适的，特别是用于获得几个叠加的细胞层。因此，只允许培养二维细胞层，即单层细胞的培养基质不是根据本专利技术的三维培养基质。优选地，根据本专利技术的三维培养基质是水凝胶。更优选地，根据本专利技术的三维培养基质是由肽的非共价结合形成的水凝胶，所述肽包括10到30个残基，如包括序列R-A-D-A的重复的肽，特别是序列 R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A (SEQ ID N0:11)。可以修饰形成水凝胶的肽，例如，通过向肽的N-端添加乙酰基以及通过在肽的C-端加入-NH2基团。因此，肽可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·拉卡萨，V·佩莱格里内利，M·乔菲帕提，K·克莱芒，
申请(专利权)人：皮埃尔和玛利居里大学巴黎第六大学，法国公立援助医院，
类型：
国别省市：