软骨祖细胞、用于细胞衍生的方案和其用途制造技术

本发明专利技术提供软骨前体细胞分离群，其中1%或更少的细胞表达Oct4、Nanog和/或TRA-1-60，7%或更少的细胞不表达II型胶原、X型胶原、CD105或Stro-1和85%或更多的细胞表达CBFA1，制备这些细胞的方法和源自所述前体细胞的软骨细胞的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术一般涉及细胞生物学、胚胎干细胞和细胞分化领域。本专利技术公开了软骨祖细胞以及制备该细胞和完全分化的软骨细胞的方法，包括所述细胞的用途。
技术介绍
软骨细胞是软骨中发现的专能细胞。软骨中的软骨细胞产生大量胞外基质，其由胶原纤维、基质组成，富含蛋白聚糖和弹性蛋白纤维。所述软骨组织在骨骼关节中起结构和机械功能，因此任何疾病或损伤引起患者虚弱。软骨退化是两种疾病组的特征：退化性病症的骨关节炎和主要由炎症引起的风湿性关节炎。所述退化引起关节疼痛和移动受损到残疾的程度。有效抑制此类疾病进展的抗炎剂开发已取得重大进展。然而，退化或损伤已发生时，需要新疗法来协助关节软骨的再生。在再生医学领域，已进行努力开发能修复软骨的细胞群。关节软骨细胞的已建立细胞系如WO 96/18728所述，软骨细胞生长和分化的方法如WO 98/55594中报道。WO 00/27996报道了软骨细胞样细胞的无血清培养基，包括最小必须培养基、生长因子、脂质和氨基酸。US 6,150,163描述了软骨细胞培养基制剂和培养程序，其中去分化的人关节软骨细胞在含TGFβ和胰岛素或胰岛素样因子的培养基中生长。已报道若未用合适的因子处理，体外培养的初级软骨细胞会去分化（Benya等Cell 198230:215）。产生的细胞形态是成纤维细胞且可为MSC-样的。Jorgensen等(Ann.Rheum.Dis.60:305,2001)综述了用于修复关节中软骨和<br>骨的干细胞的近期进展。Jakob等(J.Cell.Biochem.26:81,2001)研究了参与成人关节软骨细胞扩增和去分化的特异生长因子，其增强软骨发生和软骨形成。M.Brittberg(Clin.Orthop.367增刊:S147,1999)综述了当前软骨细胞移植方法，其中纯化软骨细胞或其他间充质细胞自体收获或作为来自健康组织来源的同种异体移植物、体外扩张、然后以高密度移植到缺陷处。尽管迄今为止报道的临床方法取得初步成功，很明显当前软骨细胞的来源不足以治疗临床本身表现出的大多数软骨退化病例。此外，有关使用免疫抑制药物的问题使成功开发新移植方案更复杂。再生医学也从有关各类祖细胞的分离、培养和使用的近期进展中收益。胚胎干细胞具有两种非常特殊的性质：首先，不同于其他常见的哺乳动物细胞类型，其可在培养基中几乎无限地增殖而维持其多潜能性，提供几乎不受限制的供给。其次，其可用于生成各种感兴趣的组织类型作为用于组织治疗或用于筛选药物试剂的替代细胞和组织来源。因此，干细胞被认为是软骨细胞的可能来源。Kramer等(Mech.Dev.92:193,2000)报道小鼠胚胎干细胞可用骨形态发生蛋白(BMP-2和BMP-4调节)以产生阿辛蓝(Alcian blue)染色（软骨细胞特征）的细胞，并表达转录因子scleraxis。然而，胚胎干细胞发育的小鼠模型不需要产生适用于其他物种的分化策略（参见例如Ginis等.(2004)Dev.Biol 269:360）。Thomson等(US 5,843,780;Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:7844,1995)首次成功从灵长类动物中分离并繁殖了多潜能干细胞。他们随后从人胚胞建立了人胚胎干细胞(hES)系（Science 282:114,1998）。Gearhart和同事从胎儿生殖腺组织建立了人胚胎生殖(hEG)细胞系(Shamblott等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:13726,1998;和US 6,090,622)。hES和hEG细胞都具有长久以来寻求的多潜能干细胞特征:其可大量培养而不分化，其具有正常的染色体组型，且其能产生许多重要细胞类型，包括来自所有三个初级胚层的细胞类型。间充质祖细胞可根据WO 03/004605所述的方法从hES细胞生成。然后hES-衍生的间充质细胞可在含成骨因子的培养基中进一步分化为成骨细胞谱系细胞，所述成骨因子如骨形态发生蛋白(具体是BMP-4)、人TGF-β受体的配体或人维生素D受体的配体(WO 03/004605;Sotile等,Cloning Stem Cells2003;5(2):149-55)。软骨细胞或其祖细胞可通过在具有WO 03/050250所列分化因子的有效组合的微团聚体中培养hES细胞来生成。Hegert等.(J.Cell Sci.115:4617,2002)报道了从由小鼠胚胎干细胞组成的胚状体衍生的软骨细胞的分化可塑性。Toh等描述了体外人胚胎干细胞的可扩增软骨生成细胞的分化和富集(J.Cell.Mol.Med.,2009-早期在线公开引用文献10.1111/j.1582-4934.2009.00762.x)。仍需要生产足量软骨谱系细胞的有效的可规模化方法，包括软骨祖细胞以及用于治疗和研究应用的成熟软骨细胞。分离稳定的软骨细胞前体是有用的，所述细胞能在可规模化条件下维持培养且能容易地分化为成熟的软骨细胞或表达蛋白如II型胶原、蛋白聚糖聚合物（aggrecan）和糖胺聚糖的细胞。然而，即使制备源自未分化祖细胞群如hES细胞的软骨细胞，仍需要在使用软骨细胞群的移植治疗中使用免疫抑制药物，所述软骨细胞群对患者移植物的长期成功不利。因此，需要开发新方法使灵长类多潜能细胞分化为完全功能性软骨细胞，其避免在移植中使用免疫抑制药物，以及能容易产生该软骨细胞的软骨前体细胞类型。还需要开发治疗性应用软骨细胞如从灵长类多潜能干细胞体外分化的软骨细胞而不用免疫抑制和/或抗炎剂的新方法。还需要开发用软骨细胞如从灵长类多潜能干细胞体外分化的软骨细胞治疗对象而不用免疫抑制和/或抗炎剂的新方法。
技术实现思路
本专利技术提供新的软骨祖细胞或前体细胞群，其特征为表达本文所定义的某些蛋白标记。细胞的特征还可为丧失转分化能力。软骨细胞前体或祖细胞群可由分化的pPS细胞通过本专利技术方法获得，且可形成具有成熟软骨细胞特征的后代。所述软骨祖细胞不再具有多潜能，但定向软骨细胞发育途径。本专利技术还提供本文定义的系统用于制备软骨细胞和软骨祖细胞或软骨前体细胞。软骨祖细胞或软骨前体细胞的分离群或体外群如下制备：在软骨生成培养基中分化灵长类多潜能干细胞（pPS）群直到所述细胞多于75%融合，然后所述细胞在定义的最小生长培养基中清洗和重悬并再培养一段时间，直到所述细胞分化成特征为丧失转分化能力的细胞群，如不能在成骨培养基中后续培养以形成成骨细胞的细胞。该培养细胞的特征还为成纤维形态、不表达ES多潜能标本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.08 US 61/321,9821.一种软骨前体细胞分离群，其中1%或更少的细胞表达Oct4、Nanog和/或
TRA-1-60，7%或更少的细胞不表达II型胶原、X型胶原、CD105或Stro-1和85%
或更多的细胞表达CBFA1。
2.一种软骨前体细胞分离群，所述细胞群特征为丧失转分化能力。
3.一种制备软骨前体细胞的方法，所述方法包括步骤：
(a)在软骨发生培养基中分化灵长类多潜能干细胞(pPS)群直到所述细胞大
于75%融合；
(b)清洗细胞并在定义的最小生长培养基中重悬；
(c)将获自(b)的细胞再培养一段时间，直到所述细胞分化为软骨前体细胞
群，所述细胞群特征为丧失转分化能力。
4.一种制备软骨前体细胞的方法，所述方法包括步骤：
(a)在软骨发生培养基中分化灵长类多潜能干细胞(pPS)群直到所述细胞大
于75%融合；
(b)清洗细胞并在定义的最小生长培养基中重悬；
(c)将获自(b)的细胞再培养一段时间，直到所述细胞分化为软骨前体细胞
群，所述细胞群特征为1%或更少的细胞表达Oct4、Nanog和/或tra-1-60，7%或更
少的细胞不表达II型胶原、X型胶原、CD105或Stro...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·S·诺贝尔，D·M·皮尔，
申请(专利权)人：爱丁堡大学管理处，
类型：
国别省市：