源于大鼠及其它动物的多潜能细胞制造技术

本发明专利技术涉及源于大鼠及其它动物的多潜能细胞，特别涉及维持多功能细胞的自我更新能力，在含有MEK抑制剂、GSK3抑制剂和FGF受体拮抗剂的无血清培养基中获得多功能细胞，并在其中保持其自我更新状态。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及维持多潜能细胞的自我更新能力。本专利技术提供的方法和组合物适于培 养及分离多潜能细胞如胚胎干细胞（ES)，尤其是哺乳动物的胚胎干细胞，哺乳动物的包括 大鼠、小鼠、牛、绵羊、猪以及人。本专利技术尤其涉及大鼠、小鼠和人的多潜能细胞的自我更新 培养以及与之相关的方法及组合物。
技术介绍
目前已广为人知的是：在体外起始及维持多潜能干细胞均是在含有血清和白血病 抑制因子（LIF)的培养基中进行的（Smithetal. (1988)Nature336:688-90)。这类方法 已被用来维持源于"许可的"（permissive)小鼠的多潜能胚胎干细胞（ES)传代（passage) 很多次。维持多潜能干细胞的自我更新还可以通过其它方式来完成，如将干细胞培养在含 有饲养细胞或其提取物的培养基中，通常用小鼠成纤维细胞作为饲养细胞。这些条件使得 在培养基中多次传代人类胚胎干细胞的同时维持其多潜能性状成为可能。 许多情况下，ES细胞仅能在含有以下成分的培养基中被维持或最好地维持，如含 有血清或血清提取物的培养基（因此这些培养基的成分是不明确的）；或者含有其它细胞 的培养基，如利用成纤维细胞作为饲养细胞的培养基。但是，任何不明确的成分，不管是本 已存在于培养基中的还是例如由饲养细胞产生的，均可能干扰或阻碍对ES细胞繁殖和分 化的研究。这阻碍了ES细胞及其子细胞在治疗学或其它应用方面的生产实践发展。目前 已有一些成分明确的ES细胞培养基，然而仍需要可供选择的、最好是改良的成分明确的ES 细胞培养基。 在本专利技术的申请人之前的公开号为W0 03/095628的国际申请，及之后还未公开 的一申请中，以下的无血清培养基被用来培养多潜能干细胞如ES细胞并促使其进行多代 自我更新，所用的无血清培养基中含有（l)gpl30激活剂（如LIF)和（2)TGF-0家族或Id 信号传导途径的激活剂（如BMP4)。意外地发现，在gpl30信号传导途径畅通的情况下， TGF-0家族或Id信号传导途径的激活剂可刺激多潜能干细胞自我更新而非向其传递分化 前信号。然而，还需要提高维持多潜能细胞自我复制性状的效率，以及改良一些培养基，这 些培养基用于将多潜能细胞从饲养细胞或含有饲养成分的培养基中转移。SatoN等（Nat.Med. 2004,Jan10(l)pp55-63)描述了糖原合成酶激酶3(GSK3)抑 制剂、6-溴靛玉红-3-月亏（6-bromoindirubin-3'_oxime)对培养在含血清培养基中的小鼠 和人ES细胞的影响。然而，仅在很短的时间段内观察了这些影响，这些观察是如此短暂以 致不能得出稳定的结论，并且研究中所用的成分不明确培养基中的未知因子的影响也可能 较显著。本专利技术的专利技术人曾经尝试过那个实验，但是不能重复获取所述实验结果，实际上观 察到了与所述结果相反的影响。 在配制ES细胞培养基时，人们希望能得到尽可能纯的单独培养基成分。然而，大 部分培养基成分是细胞因子，由于需要在细胞中生产它们继而去除所得产物中潜在的污染 物，这些细胞因子的纯度难以保证。一些细胞因子的另一个问题是：它们仅在很窄的浓度范 围内是有效且无毒的。有较宽浓度范围和/或在较高浓度下具有较小毒性的培养基成分会 很有用。细胞因子的储存稳定性有限，人们也在寻找更稳定的培养基成分。 本专利技术的一个目的是克服或至少改善现有技术中存在的问题，希望提供可供选择 的最好是改善的培养多潜能干细胞的方法和培养基，这些培养基和培养方法能够支持所述 干细胞进行多代自我更新。本专利技术的另一个目的是提供一种可供选择的培养体系以能够在 体外培养多潜能干细胞并维持其性状直至以可控方式诱导这些干细胞的分化。本专利技术的一 个更进一步的目的是为改善多潜能干细胞的获得和分离提供方法和组合物，方便从难处理 器官及尚未分离出多潜能干细胞的器官中获取并分离出多潜能干细胞。本专利技术一个更进一 步的目的是从这些器官中得到多潜能干细胞。
技术实现思路
根据本专利技术的一方面，通过抑制多潜能细胞中的GSK3、MEK和一FGF受体可以促进 多潜能细胞的自我更新。 根据本专利技术，多潜能干细胞如ES细胞，被培养在含有一种MEK抑制因子、一种GSK3 抑制因子和一种FGF受体拮抗剂（例如一种小分子GSK3抑制因子、一种小分子MEK抑制因 子和一种小分子FGFR拮抗剂）的培养基中，优选使用无血清培养基，从而促进干细胞进行 多代的自我更新。因此，抑制多潜能细胞中的GSK3、MEK和FGF受体传导途径刺激了这些细 胞的自我更新。 本专利技术有几方面的应用。可分别通过以下几种组合的抑制来培养多潜能细胞尤其 ES细胞，并使它们适应在无饲养细胞或饲养细胞层（常被称为饲养者或饲养细胞）的培养 基中生长，所述细胞最初起源或被接种于饲养细胞，所述组合是：GSK3和MEK、MEK和FGFR 或GSK3、或MEK和FGFR。在培养基中扩增干细胞的一种方法包括在以下培养基中培养干细 胞，所述培养基含有一种GSK3抑制因子和一种MEK抑制因子，一种MEK抑制因子和一种FGF 受体拮抗剂，或优选同时含有一种GSK3抑制因子、一种MEK抑制因子和一种FGF受体拮抗 齐U。所用的培养基可以含有一或多种GSK3抑制因子和MEK抑制因子，一或多种MEK抑制 因子和FGFR拮抗剂，或者一或多种MEK抑制因子、GSK3抑制因子和FGFR拮抗剂。可利用 GSK3抑制因子和MEK抑制因子，MEK抑制因子和FGFR拮抗剂，或GSK3抑制因子、MEK抑制 因子和FGFR拮抗剂制备ES细胞，包括那些源于某些器官的ES细胞，迄今为止尚未从这些 器官中分离得到过ES细胞。 本专利技术涉及的多潜能细胞包括但不限于ES细胞。多潜能细胞（包括ES细胞）的 特性包括表达多种与多潜能发育阶段相关的基因，能分化为同一主体动物中的任意及所有 组织的典型细胞的能力，助于形成嵌合体的能力，尤其助于形成嵌合种系的能力。真正的多 潜能细胞，例如ES细胞，即使不表达所有，也应该可以表达很多种与多潜能相关的基因，如 Nanog、0ct4、FGF4、Sox_2和碱性磷酸酶。特别地，Nanog、0ct4和Sox-2的表达被广泛认为 是确定一细胞为ES细胞的决定性最初表征。嵌合体的种系传递以及可从三个原胚层（如 内胚层、中胚层和外胚层）产生含有分化细胞的畸胎瘤的能力也被广泛认为是确定一细胞 为ES细胞的决定性指征。所述的GSK3抑制因子指的是抑制一或多个GSK3酶的抑制因子。因此，一个GSK3 抑制因子可以抑制一个、几个或所有GSK3酶家族成员。GSK3酶家族广为人知，其包括但 不限于GSK3-a和GSK3-0。已经发现了几种变体（参见Schafferetal.;Gene2003; 302(1-2) :73-81)。在一些实施例中抑制的是GSK3-P，GSK3-a抑制因子也是合适的，总 体上本专利技术采用的抑制因子可抑制此两种酶。已经知道很多种GSK3抑制因子，例如CHIR 98014、CHIR99021、AR-A0144-18、TDZD-8、SB216763 和SB415286。其它已知的抑制因子在 本专利技术中也是有益的。此外，GSK3-0活性位点的结构已被表征，与特异和非特异抑制因子 结合的重要残基也已确定（本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大鼠多潜能细胞，特征在于其表达Nanog、Oct4、FGF4和Sox‑2中两个或多个基因。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：应其龙，A·G·史密斯，
申请(专利权)人：爱丁堡大学管理处，
类型：发明
国别省市：英国;GB