大鼠淋巴细胞CD4基因定量表达测试用引物、探针制造技术

一种大鼠淋巴细胞ＣＤ４基因定量表达测试用引物、探针，其特征在于：所述的引物序列中，上游引物１２３Ｕ的序列为５’ＧＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＴ３’，下游引物２１３Ｌ的序列为５’ＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＣＧＣ３’；探针１４０－ＦＴ的序列为５’ＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＧ３’。本发明专利技术的优点：本基因、探针和引物的灵敏度和特异性好，实时相对定量分析，准确性高，操作简单，只需一步，所需样本量小。采用实时相对定量分析方法检测到外周血淋巴细胞ＣＤ４基因表达水平峰值与流式细胞仪检测到ＣＤ４免疫分子表达峰值时间一致，比免疫组化测定到移植心肌组织中ＣＤ４＋淋巴细胞浸润峰值提前４天。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种大鼠淋巴细胞CD4基因定量表达测试用引物、探针技术背景器官移植是20世纪医学领域中发展最快的医学技术之一。许多病人晚期往往伴有心脏、肺脏、胰腺、肝脏、肾脏等大器官功能的衰竭，通过器官移植将正常器官代替这些病变或功能衰竭的器官，已成为最有效的治疗手段。CD4分子是一个糖蛋白，其在T细胞的活化中主要有以下两种功能充当细胞与细胞的黏附分子，和在与II类MHC分子结合时可能传递信号或促进TCR复合物介导的信号传导。由于CD4分子在T淋巴细胞的活化中起重要作用，因此，对免疫系统疾病及器官移植后CD4分子及基因表达水平的检测是监测免疫排斥反应和诊断某些疾病的理想手段。有报道指出，移植心脏的慢性排斥反应与CD4+淋巴细胞有关，并依赖于CD8+淋巴细胞。已有的免疫分子基因表达的测定方法包括基因差异显示灰度扫描方法、原位杂交(sorthen blot)技术，但上述方法较复杂、精确性和重复性差、且有同位素污染等问题，因此有必要提供一种适应快速精确定量测定的引物和探针。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大鼠淋巴细胞CD4基因定量表达测试用引物及探针，利用该引物及探针可对大鼠淋巴细胞CD4基因作荧光PCR实时定量检测，由于本引物、探针具有与待测基因同源的高特异性和高亲合性，可获得高灵敏度、高精确性的结果。为达到上述目的本专利技术采用以下技术方案本专利技术提供的引物和探针序列为cDNA探针140-FT5’CCCCTTCCTTCCCCAGCACCACG 3’引物123U5’GTCACCCAAGGAAAGACCGT 3’213L5’TTTTGGTCAGAGGACTTCCACGC 3’CD4基因全序及其探针、引物位置见附件一其中123U为上游引物，是正链140-FT为探针，是反链213L为下游引物，是反链附图说明图1实时荧光定量PCR测定的5个不同样本的CD4和β-actin的扩增曲线(实验中某一时间点)图2为大鼠心脏移植术前后不同时间移植心肌组织中CD4+淋巴细胞浸润、外周血淋巴细胞免疫分子CD4表达及其基因定量表达曲线的比较 图3同一样本的不同模板浓度的扩增曲线比较4CD4特异性引物的扩增产物的琼脂糖电泳5PCR反应中CD4特异性引物工作原理6CD4特异性探针示意图大鼠CD4基因特异性引物及探针的基本工作原理PCR反应中CD4特异性引物工作原理(见图5)。CD4基因特异性引物在PCR反应中的退火温度时与逆转录后开链CD4的cDNA核苷酸链的特定区域完全互补结合，并在延伸温度时引导相应CD4核苷酸链的复制扩增。过程如图示。其特点由于引物的特异性，实现了PCR反应时只进行CD4基因cDNA的复制与扩增，没有非特异性基因的扩增。CD4基因的特异性探针(见图6)。本实验所设计的探针为Taqman探针，探针5’连接一个Fam荧光基团(此荧光基团在520-740um波长范围内均能检测到)，3’端连接1个Tamra淬灭基团，此两基团均为DNA合成仪自动标记。PCR反应时特异探针首先与前次逆转录生成的CD4 cDNA特定区域核苷酸序列实现完全互补结合，但由于此时，荧光报告基团被淬灭基团所控制不发荧光。在下一次循环扩增时，Taq酶在特异性引物引导下与模板结合延伸至特异性探针与模板结合的位置时，其中的Taq酶在60℃时将特异性探针切断，荧光报告基团与淬灭基团分开，致使荧光基团发光，同时定量PCR仪记录荧光强度，用于定量此次扩增前cDNA的模板数。本专利技术中采用了以β-actin作为参照物的起始拷贝数的相对定量方法。由于淋巴细胞β-actin mRNA的表达水平只与细胞数有关，且其在细胞中含量恒定，所以本实验以β-actin作为参照物。利用实时荧光定量PCR技术对同一样本总RNA中的β-actin和CD4基因表达水平同时进行测定。设每个基因在40个扩增循环中，荧光强度从基线开始增加的循环数为Ct。即Ct值表示基因开始扩增时的起始循环数，(反映模板基数)。因为cDNA的模板基数每增加10倍，开始扩增的循环数(Ct值)减少3.33，故不同样本模板基数的差可由公式10(CtA-CtB)/3.33计算。CD4相对于β-actin模板数的倍数为10(CD4-β-actin)/3.33.，倍数越大，说明CD4基因的起始模板数越低，即数字增加表示负调表达。图1中，实时荧光定量PCR测定的CD4与β-actin(见图1)的反应曲线，下箭头为β-actin，上箭头为CD4。其中以大鼠心脏移植术前某一时间点为例，见表1表1编号 CD4(Ct值) β-actin(Ct值) 10(CD4-β-actin)/3.331 12.87 8.124 26.6212 12.93 8.295 24.6543 13.33 8.640 25.6104 13.72 8.983 26.4565 18.55 14.57 15.675均值 23.8±4.61上述表中，均值23.8±4.61表示五例外周血淋巴细胞CD4基因对β-actin编码基因的相对起始模板倍数，数字增加表示负调表达。外周血淋巴细胞CD4免疫分子表达、CD4基因表达和移植心肌组织中CD4+淋巴细胞浸润等三者比较结果见表2和图2。作为对比实验的外周血淋巴细胞CD4免疫分子表达测定1.单克隆抗体(mAb)标记取200μL抗凝血，根据Immunotech公司的说明书，加入荧光标记的抗RAT CD4 mAb 10μL，混匀，于4℃暗箱孵育30min。标记后，用红细胞裂解液裂解红细胞(室温放置4min)，离心1500rpm/min 3min，弃上清，在相同离心条件下，用含2％小牛血清的0.01mol/L PBS涤洗白细胞2遍，加PBS至0.5mL，制成白细胞悬液。2，流式细胞分析白细胞悬液过滤后，用XL A27153型流式细胞仪，测定被抗CD4单抗标记的淋巴细胞百分数(％)。作为对比实验的移植心肌组织中免疫荧光细胞染色分别取移植前SD大鼠的原位心脏和移植后各时间组的移植心脏，冰冻后于中远1/3处横段面切片，95％乙醇固定30min，PBS洗涤3次，每次5min，用荧光标记的抗CD4单克隆抗体标记，37℃恒温孵育30min，PBS洗涤3次，每次5min，甘油封片后4℃避光保存，荧光显微镜下进行CD4+淋巴细胞记数。外周血淋巴细胞CD4基因表达水平与外周血淋巴细胞CD4免疫分子表达水平、免疫组化方法测定移植心肌中CD4+淋巴细胞浸润数的比较(见表2和图2)。表2大鼠心脏移植前后移植心肌组织中CD4+淋巴细胞浸润数、外周血淋巴细胞CD4分子表达与CD4基因表达的比较。术前术后24h 72h 7d 10d12dCD4+浸润15.54.8 5.3 11.89.211.8CD4分子 65.443.7 49.850.451.7 46.5CD4基因 46.16 31.6658.49 56 45.7 57.1表中CD4基因表达的数字为外周血淋巴细胞CD4基因对β-actin编码基因的模板倍数，数字增加表示负调表达。图2中，有三条曲线，1为CD4+淋巴细胞浸润曲线，曲线上的A点表示浸润量出现峰值的时间为7天；2为CD4免疫分子表达，曲线上的B点表示表达量出现峰值的时间为72小本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大鼠淋巴细胞ＣＤ４基因定量表达测试用引物、探针，其特征在于：所述的引物序列中，上游引物１２３Ｕ的序列为５’ＧＴＣＡＣＣＣＡＡＧＧＡＡＡＧＡＣＣＧＴ３’，下游引物２１３Ｌ的序列为５’ＴＴＴＴＧＧＴＣＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＣＡＣＧＣ３’；探针１４０－ＦＴ的序列为５’ＣＣＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＣＣＡＣＧ３’。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：黄益民，顾云，张颖，朱文斯，
申请(专利权)人：北京市心肺血管疾病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]