大鼠淋巴细胞P59*基因定量表达测试用引物、探针制造技术

一种大鼠淋巴细胞Ｐ５９↑［ｆｙｎ］基因定量表达测试用引物、探针，其特征在于：所述的引物序列中，上游引物３７８Ｕ的序列为５’ＴＣＧＣＧＧＴＧＡＡＧＧＣＴＡＴＧＴ３’，下游引物４８５Ｌ的序列为５’ＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡ３’；探针４２３－ＦＴ的序列为５’ＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ３’。本发明专利技术的优点：本基因、探针和引物的灵敏度和特异性好，实时相对定量分析，准确性高，操作简单，所需样本量小，采用实时相对定量分析方法检测到Ｐ５９↑［ｆｙｎ］基因表达水平峰值与移植心脏心肌组织中的ＣＤ４＋、ＣＤ８＋淋巴细胞浸润时间相一致。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种大鼠淋巴细胞P59fyn基因定量表达测试用引物、探针技术背景目前，器官移植仍是治疗许多器官及组织终末期病变的有效方法。但是免疫排斥反应也仍然是目前导致器官移植治疗失败的最主要原因之一。由于供体来源的限制使得不能实现供体与受体的优化配型，因此同种异体抗原仍然是导致排斥反应的直接原因，这也使得临床器官移植的成功更依赖于免疫排斥反应的早期发现和及时防治。P59fyn是磷酸酪氨酸激酶(PTKs)家族成员之一，主要在T细胞中表达，并连接于CD4和CD8的胞浆尾部。是T细胞活化信号传导通路中的重要成分。当T细胞受体TCR及CD4或CD8在细胞膜表面对抗原呈递细胞APC呈递的抗原肽-MHC复合物发生识别时，CD4或CD8尾部结合的包括P59fyn在内的酪氨酸激酶被促使至少与TCR复合物蛋白中的细胞免疫分子CD3的胞浆尾部作用，催化其相关的酪氨酸结构域中的酪氨酸磷酸结合位点发生磷酸化，将免疫信号传导到T细胞内，并介导激活一系列细胞免疫分子的基因转录和表达，活化T细胞。因此酪氨酸蛋白激酶P59fyn的基因表达是T细胞活化早期的代表性指征。已有的免疫分子基因表达的测定方法包括基因差异显示灰度扫描方法、原位杂交(sorthen blot)技术等，但上述方法较复杂、精确性和重复性差、且有同位素污染等问题，因此有必要提供一种适应快速精确定量测定免疫分子基因表达水平的引物和探针。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种大鼠淋巴细胞P59fyn基因定量表达测试用引物及探针，利用该引物及探针可对大鼠淋巴细胞P59fyn基因作实时荧光PCR定量检测，由于本引物、探针具有与待测基因同源的高特异性和高亲合性，可获得高灵敏度、高精确性和重复性的结果。为达到上述目的本专利技术采用以下技术方案本专利技术提供的引物和探针序列为cDNA探针423-FT 5’TGCAGCACCCTTCCAGCGCAACC 3’引物378U 5’TCGCGGTGAAGGCTATGT 3’485L 5’CCAGGTTCTCCCCCTCACTAA 3’P59fyn基因全序及其探针、引物位置见附件一其中378U为上游引物，是正链 423-FT为探针，是反链485L为下游引物，是反链附图说明图1实时荧光定量PCR测定的不同样本的β-actin及P59fyn基因扩增曲线(实验中某一时间点)图2为大鼠心脏移植术前后不同时间移植心肌组织中CD4+、CD8+淋巴细胞浸润曲线及P59fyn基因定量表达曲线比较图3P59fyn不同模板浓度时扩增曲线的比较图4P59fyn基因扩增产物的琼脂糖电泳5PCR反应中P59fyn特异性引物工作原理6P59fyn特异性探针示意图具体实施方式以下通过实施例对本专利技术作进一步说明本专利技术中实验用大鼠淋巴细胞P59fyn基因特异性探针及引物的获得方法首先根据P59fyn基因全序，用引物设计软件包进行大鼠淋巴细胞P59fyn特异性探针及引物的设计，并对所设计的引物及探针进行筛选，从中挑选出最佳引物及探针组合进行实验。实施例1，实验分组选wistar大鼠为受体，SD大鼠为供体，体重200-220g，雌雄各半(购于军事医学科学院动物中心一二级动物)。分为6个时间组，即移植前组、心脏移植后24h、72h、7d、10d、12d组，每组6只大鼠。2，血样采集各组wistar大鼠分别于移植前后相应时间点，经3％戊巴比妥钠腹腔麻醉，腹主动脉取血4ml，2％EDTA 1∶9抗凝。用于提取总RNA及定量PCR检测，同时取移植心脏做病理切片进行免疫组化测定CD4+和CD8+淋巴细胞浸润数。3，总RNA提取淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。采用Trizol法(GIBCO公司试剂盒)按说明书操作将淋巴细胞加入1ml Trizol使细胞裂解，4℃离心12000rpm 10分钟，取上清，加0.2ml氯仿震荡混匀，4℃离心12000rpm 20分钟，取最上层加0.5ml异丙醇，12000rpm 4℃离心15分钟，弃上清留沉淀，加入1ml 75％乙醇，轻摇溶解RNA，7500rpm4℃离心5分钟，弃上清，乙醇挥发后将总RNA溶于50μl 0.1％DEPC水中。4，逆转录PCR(RT-PCR)及定量PCR反应体系为24ul，包括总RNA 2ul(5ug/ml)、Mg2SO41ul(25uM)、dNTP 1ul(10mM)、RT-PCR酶混合物1ul、buffer 5ul，β-actin或P59fyn基因上下游特异性引物各2ul(31.25uM)，β-actin或P59fyn基因特异性探针2ul(3.13uM)，其余用0.1％DEPC水补足，反应条件为42℃ 30分，95℃变性15分钟，1个循环；94℃变性30秒，58℃退火60秒，72℃延伸60秒，5个循环；94℃变性10秒，60℃延伸60秒，共40个循环；最后降温至40℃。大鼠P59fyn基因特异性引物及探针的基本工作原理PCR反应中P59fyn特异性引物工作原理(见图5)。P59fyn基因特异性引物在PCR反应中的退火温度时与逆转录后开链P59fyn的cDNA核苷酸链的特定区域完全互补结合，并在延伸温度时引导相应P59fyn核苷酸链的复制扩增。过程如图示。其特点由于引物的特异性，实现了PCR反应时只进行P59fyn基因cDNA的复制与扩增，没有非特异性基因的扩增。P59fyn基因的特异性探针(见图6)。本实验所设计的探针为Taqman探针，探针5’连接一个Fam荧光基团(此荧光基团在520-740um波长范围内均能检测到)，3’端连接1个Tamra淬灭基团，此两基团均为DNA合成仪自动标记。PCR反应时特异探针首先与前次逆转录生成的P59fyncDNA特定区域核苷酸序列实现完全互补结合，但由于此时，荧光报告基团被淬灭基团所控制不发荧光，在下一次循环扩增时，Taq酶在特异性引物引导下与模板结合延伸至特异性探针与模板结合的位置时，其中的Taq酶在60℃时将特异性探针切断，荧光报告基团与淬灭基团分开，致使荧光基团发光，同时定量PCR仪记录荧光强度，用于定量此次扩增前cDNA的模板数。本专利技术中采用了以β-actin作为参照物的起始拷贝数的相对定量分析法。由于淋巴细胞β-actin mRNA的表达水平只与细胞数有关，且其在细胞中含量恒定，本实验以β-actin作为参照物。利用实时荧光定量PCR技术对同一样本模板的β-actin和P59fyn基因表达水平同时进行测定。设每个基因在40个扩增循环中，荧光强度从基线开始增加的循环数为Ct。即Ct值表示基因开始扩增时的起始循环数，(反映模板基数)。因为cDNA的模板基数每增加10倍，开始扩增的循环数(Ct值)便减少3.33，故不同样本模板基数的差可由公式10(CtA-CtB)/3.33计算。P59fyn相对于β-actin模板数的倍数为10(P59fyn-β-actin)/3.33。图1中，下箭头为β-actin，上箭头为P59fyn其中以大鼠心脏移植术前某一时间点四例样本的测试结果为例，见表1 表1编号 P59fynβ-actin 10(p59-β-actin)/3.33112.447.69226.658212.837.80332.330312.318.02719.328413.957.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大鼠淋巴细胞Ｐ５９基因定量表达测试用引物、探针，其特征在于：所述的引物序列中，上游引物３７８Ｕ的序列为５’ＴＣＧＣＧＧＴＧＡＡＧＧＣＴＡＴＧＴ３’，下游引物４８５Ｌ的序列为５’ＣＣＡＧＧＴＴＣＴＣＣＣＣＣＴＣＡＣＴＡＡ３’；探针 ４２３－ＦＴ的序列为５’ＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＴＣＣＡＧＣＧＣＡＡＣＣＣ３’。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄益民，顾云，张颖，朱文斯，
申请(专利权)人：北京市心肺血管疾病研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]