一种Ｙ染色体多色荧光复合扩增试剂盒，其特征是由分离包装的引物混合物、ＤＮＡ聚合酶、缓冲液、ＭｇＣｌ↓［２］和等位基因分型标准物混合物构成，所述引物混合物由四对荧光公共引物ＹＡ和ＹＢ１、ＹＡ和ＹＢ２、ＹＡ和ＹＢ３、ＹＡ和ＹＢ４以及对应于Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四组Ｙ染色体特异ＳＴＲ基因座的加尾引物混合而成，其中，四对荧光公共引物ＹＡ和ＹＢ１、ＹＡ和ＹＢ２、ＹＡ和ＹＢ３、ＹＡ和ＹＢ４中的荧光公共引物ＹＡ和ＹＢ１、ＹＢ２、ＹＢ３、ＹＢ４为： ＹＡ（５′－－ＧＴＴＣＴＴ－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ－３′） ＹＢ１（５′－－Ｆ１－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣ－３′） ＹＢ２（５′－－Ｆ２－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＧＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＧ－３′） ＹＢ３（５′－－Ｆ３－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＡＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡ－３′） ＹＢ４（５′－－Ｆ４－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＴＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＴ－３′）； 分别加于荧光公共引物ＹＢ１、ＹＢ２、ＹＢ３、ＹＢ４的５′端的Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４为荧光标记物； 对应于Ａ组Ｙ染色体特异ＳＴＲ基因座的加尾引物ＹＰＡ－Ａ（Ｐ１）和ＹＰＢ１－Ａ（Ｐ２）为分别在Ａ组基因座中的四个基因座的原始引物Ｐ１、Ｐ２的５′端加上公共引物ＹＰＡ、ＹＰＢ１： ＹＰＡ（５′－－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ－３′） ＹＰＢ１（５′－－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣ－３′） 而得到的基因组序列； 对应于Ｂ组Ｙ染色体特异ＳＴＲ基因座的加尾引物ＹＰＡ－Ｂ（Ｐ１）和ＹＰＢ２－Ｂ（Ｐ２）为分别在Ｂ组基因座中的四个基因座的原始引物Ｐ１、Ｐ２的５′端加上公共引物ＹＰＡ、ＹＰＢ２： ＹＰＡ（５′－－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ－３′） ＹＰＢ２（５′－－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＧＴＡＴＡＧＧＧＡＣＡＧ－３′） 而得到的基因组序列； 对应于Ｃ组Ｙ染色体特异ＳＴＲ基因座的加尾引物ＹＰＡ－Ｃ（Ｐ１）和ＹＰＢ３－Ｃ（Ｐ２）为分别在Ｃ组基因座中的四个基因座的原始引物Ｐ１、Ｐ２的５′端加上公共引物ＹＰＡ、ＹＰＢ３： ＹＰＡ（５′－－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ－３′） ＹＰＢ３（５′－－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＡＴＡＴＡＧＧＧＡＴＡＡ－３′） 而得到的基因组序列； 对应于Ｄ组Ｙ染色体特异ＳＴＲ基因座的加尾引物ＹＰＡ－Ｄ（Ｐ１）和ＹＰＢ４－Ｄ（Ｐ２）为分别在Ｄ组基因座中的四个基因座的原始引物Ｐ１、Ｐ２的５′端加上公共引物ＹＰＡ、ＹＰＢ４： ＹＰＡ（５′－－ＡＴＴＴＡＧＧＴＧＡＣＡＣＴＡＴＡＧＡＡＴＡＣ－３′） ＹＰＢ４（５′－－ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＴＴＡＴＡＧＧＧＡＡＡＴ－３′） 而得到的基因组序列； 所述等位基因分型标准物混合物由Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ四组Ｙ染色体特异ＳＴＲ基因座中的各个基因座的等位基因分型标准物混合而成； 各组份的用量比为：引物混合物中四对荧光公共引物ＹＡ和ＹＢ１、ＹＡ和ＹＢ２、ＹＡ和ＹＢ３、ＹＡ和ＹＢ４各０．２５～０．３５ｍｌ（４００ｎＭ），３２条对应于１６个Ｙ染色体特异ＳＴＲ基因座的加尾引物各０．２５～０．３５ｍｌ（４００ｎＭ）；ＤＮＡ聚合酶３０００ｕ（３ｕ／μ１）；缓冲液３．２５～４．２５ｍｌ；ＭｇＣｌ↓［２］２．５～３．５ｍｌ（２．２５ｍＭ）；等位基因分型标准物混合物总量１６ｍｌ（４０ｎＭ），等位基因分型标准物混合物中所含各个基因座的等位基因分型标准物等量。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于体外一次性复合扩增Y染色体上的多个DNA目的片段的试剂盒。
技术介绍
STR是短串联重复序列的简称，是一类核心序列为2～6个bp长的串联重复序列，其片段长度在几十个bp至几百个bp之间。由于其片段短，扩增效率高、对PCR的条件要求也相对较低，即使是法医学上常见的细胞已经被破坏，DNA降解严重的腐败检材或是放置时间很长的检材，同样可以用PCR技术扩增出特异的DNA片段来进行基因分型，达到个人认定的目的。由于STR分型具有上述这些十分突出的优越性，因此，几乎全世界的司法鉴定DNA实验室都在采用这一技术，并已经基本上取代了其他DNA分析方法。人类Y染色体是小的近端着丝粒染色体.它由长臂(Yq)和微小的短臂(YP)两部分组成。Y染色体(除拟常染色体区外)在减数分裂中不发生交换重组，呈单倍型独立向下传递，表现出父系遗传特征；序列的变异完全由累积的突变所致，并非重组引起。由于Y染色体的这些特点，使得对Y染色体上多态性遗传标记，如Y染色体特异短串联重复序列(Y-STR)的研究不仅在人类学、古生物学等方面意义重大，而且在法医学的个人识别及亲子鉴定中亦具有重要而独特的应用价值，可以应用于多种法医学领域，如男女混合斑检验、不同男性个体成分混合物(斑)分析、父权鉴定等等。然而，应用于法医学实践的Y染色体遗传标记位于Y染色体的非重组区，整个非重组区相当于一个遗传标记。因此Y染色体遗传标记的个人识别能力和亲权鉴定能力不能像常染色体那样使用相乘原则。为了达到足够的排除概率和个人识别概率，就必须不断的增加新的Y染色体遗传标记。另一方面，实际检案对法医DNA分析有明确的时间要求，急需快速高效的检测方法。因此，亟待开发高复合程度的Y-STR复合体系，将更多变异度高的基因座复合起来一次扩增以满足法医学个人识别和亲权鉴定的需要。复合扩增(Multiplex PCR)又称为多重PCR，即在一个反应体系中使用多套引物，针对多个DNA模板或同一模板的不同区域进行扩增的过程。它可大幅度地简化操作程序、节省时间和试剂。并且满足同时分析不同DNA序列的需要，特别是在法医学鉴定中可以用极微量的检材同时扩增出多个遗传标志而更显其优越性。因此，Y染色体STR基因座的复合扩增一直是国内外相关实验室研究的重点。基于检测体系的不同，目前世界上将复合扩增主要可以分为两大类银染复合扩增和荧光复合扩增。银染复合扩增是复合扩增后的产物利用普通电泳槽分离，进行硝酸银染色检测的方法。方法简单，成本较低，在普通实验室可以开展这个项目。但由于所得结果只是单种颜色，故其复合扩增试剂盒的位点数不能太多，一般1次复合扩增的位点不能超过4个，否则会因为不同位点的扩增产物互相重叠，难以区分检材的基因型。再加上所得结果是用肉眼观察，所以其灵敏度受到一定的限制。荧光复合扩增是在普通复合扩增PCR的其中一条引物(任何PCR反应都必须有两条引物)一端加上荧光标记，利用STR分型技术主要检测平台——自动激光荧光遗传检测仪进行检测PCR扩增产物。荧光标记STR分型技术所需检材量少，对陈旧、腐败检材适用性强，结果准确、灵敏度高，自动化程度高、可重复性强等。用一种颜色的荧光素标记一组3或4个STR位点(其扩增片段不能相重叠)，另一种颜色的荧光素标记另一组3或4个STR位点，多种荧光素则可以标记多组不同的STR位点。加在一起，就可以达到1次检测12至16个STR位点，其个人识别力则会大大提高。基于以上几个原因，荧光复合扩增已成为目前法医学领域用得非常普遍和先进的复合扩增方法。荧光复合扩增的技术核心主要在于引物结构与荧光标记的位置。近年来，Y染色体STR复合扩增的文献发表了许多，大多是将原始的用于单独扩增的引物直接复合扩增，并用荧光标记。但是，随着复合扩增体系中引物数量的增加，引物之间的相互影响越严重，反应动力学变得越复杂，成为进一步增加复合扩增位点的瓶颈和难点。由于大都采用荧光标记检测，多色荧光体系包含至多6-8个基因座，整个体系的效能不高，大大浪费了有限的检测范围。Butler等人开发出的针对Y染色体STR五色荧光复合扩增体系，一次可以检测20个基因座。他们从整体的观念出发将所有基因座引物重新设计，既调整了基因座扩增片断大小，又使其具有相近的退火温度，从而得到良好的扩增效率。但是由于重新设计引物，得到的资料与原始引物的兼容性受到了巨大考验，比如引物结合区突变问题，必须重新考察。因而探索在不降低灵敏度的情况下复合更多的位点、条件易于优化的新方法对于法医复合扩增的进一步发展很有必要。迄今为止，商品化的Y染色体STR复合扩增试剂盒只有一个Y-plexTM 6(Reliagene Technologies，Inc)双色荧光标记了六个基因座DYS19、DYS385、DYS389II、DYS390、DYS391、DYS393。其在法医学应用实践中还存在以下问题(1)这些STR基因座都是基于中国群体以外的群体(主要是白人群体)资料而开发的，有的基因座在中国群体的基因频率分布较差，个人识别能力较低。(2)此外，Y-plexTM 6提供的STR基因座还远远满足不了法医实际工作的需要。(3)国外商品化试剂盒价格昂贵。本申请人曾在中国专利技术专利申请02133812.4号中公开了一种复合扩增STR的引物设计方法，该方法以两条非人类的基因组序列YPA(5′--ATTTAGGTGACACTATAGAATAC-3′)YPB(5′--TAATACGACTCACTATAGGGAGAC-3′)，作为一对短引物；同时，在能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物对的5′端分别加上该对短引物，得到长引物对。上述方法中短引物的选取是关键，在选定短引物之后，一个待扩增的基因座的长引物也就相应被选定。这是因为，长引物中的能够与人类基因组序列特异性结合的寡核苷酸引物实际上就是可以与待扩增基因座的人类基因组特异性结合的原始引物，它由待扩增基因座的人类基因组序列所决定，且因待扩增基因座的序列的不同而不同。在上述方法中，所设计的长、短引物能够用于在同一PCR反应体系中同时对四个基因座的目的基因进行复合扩增。在复合扩增的第一阶段，利用长引物扩增出同时带有目的基因片段和与短引物配对的非人类基因组序列的产物；而在复合扩增第二阶段，则利用一对短引物对多个基因座的目的基因片段同时进行扩增。利用上述方法设计的引物能够大量扩增目的基因片段，且无需在实验过程中繁琐地调整各对引物的浓度，简化了整个实验过程，从而具有优点。与上述引物设计方法相对应，本申请人又在中国专利技术专利03117426.4号中提供了一种Y染色体复合扩增银染试剂盒，该试剂盒由是由分离包装的短引物YPA、短引物YPB、缓冲液(无Mgcl2)、DNA聚合酶、Mgcl2、A基因座长引物、B基因座长引物、C基因座长引物、D基因座长引物以及人工等位基因分型标准物构成。利用该试剂盒，就能方便地同时对Y染色体上的任意四个STR基因座进行复合扩增，同时，利用该试剂盒提供的等位基因分型标准物，还可以方便地检测扩增结果。但是，由于上述试剂盒仍然属于银染复合扩增的试剂盒，在对扩增结果进行检测时，必然存在着前面述及的费时、自动化程度不高，准确性较差等弊病，虽然其对实验设备的要求不高，符合当前中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯一平，张霁，石美森，李英碧，应斌武，吴谨，颜静，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：
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