评估结肠直肠癌制造技术

通过分析一组基因的表达对相信患有结肠直肠癌的患者的结肠直肠癌存在与否或其可能状态进行评估的方法。本发明专利技术还涉及以多种媒介物，如微阵列作为含有基因表达分布图的试剂盒。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
背景本申请要求2002年3月29日申请的序列号为60/368,798的美国临时申请的利益。本专利技术涉及基于生物样本基因表达分布图的结肠直肠癌的诊断和预测。结肠直肠癌是一种异源疾病，由据认为是通过三种主要分子机制形成的肿瘤组成1)与染色体不稳定性相结合的多发性结肠腺癌(APC)基因，或β-连环蛋白基因的突变，2)与微卫星序列不稳定性相关的DNA错配修复基因如MLH1，MSH2，PMS2和MSH6的突变，和包含短重复序列基因的突变，以及3)由肿瘤抑制基因启动子区的过甲基化诱导的基因沉默。结肠直肠癌个体的遗传互补可能包括遗传不稳定性、特异突变和基因沉默的不同结合。染色体不稳定性(CIN)一般是癌症的普遍特征。它意味着其中所有的或大部分的染色体丢失或增加了的非整倍体表型。伴随短重复序列突变率的增加，在二倍体肿瘤中发现了微粒体不稳定性(MIN)。这两种遗传不稳定性的形式在结肠直肠癌中很普遍。因此结肠直肠癌具有复杂的起源并且包括不同生物通路间大量的相互作用。用于协助提供诊断、预测或治疗监测结果的血清标记、组织学和细胞学检查通常不具有所期望的可信度。同时，使用单独的遗传标记(例如一特殊基因的表达增加)可能是有益的，癌症的多样性使遗传标记的组合可能成为最好的途径。专利技术概述本专利技术是评估结肠直肠癌存在或不存在，或者被认为患有结肠直肠癌的患者其可能状态的方法。在本方法中，通过分析患者样本的基因表达分布图确定患者是否得了结肠直肠癌，患者是否未得结肠直肠癌，患者是否可能要得结肠直肠癌，或正在接受治疗的结肠直肠癌患者对治疗的反应。本专利技术的一个方面涉及用于实施该方法的制品。这样的制品包括基因表达分布图或固定于机器可读媒介如计算机可读媒介的基因表达分布图的表现物。用来鉴别基因表达分布图的制品也可以包括用于捕捉和/或显示基因存在，缺失或表达程度的基片或平面，如微阵列。专利技术详述很少发现组织样本中单纯的特定核苷酸序列的存在或缺失具有诊断或预测价值。另一方面，关于多种蛋白、肽或mRNA表达的信息正越来越受到重视。具有表达蛋白、肽或mRNA(这样的序列是指“基因”)的潜在可能的特定核苷酸序列仅在给定细胞的基因组中存在并不能决定该蛋白、肽或mRNA一定会在给定的细胞中表达。给定的基因能否表达蛋白、肽或mRNA以及表达到何种程度取决于多种复合因子。不考虑理解和评估这些因子的困难程度，检测基因表达可以为如肿瘤发生、转移、细胞凋亡以及其他临床有关现象等重要事件的发生提供有用的信息。通过基因表达分布图可以发现基因激活或失活程度的相对指标。本专利技术的基因表达分布图可用于结肠直肠癌患者的诊断和治疗。样品制备需要收集患者样本。本专利技术使用的病例样本是那些疑为含有患病细胞的样本，如取自结肠样本或外科切除样本的上皮细胞。获得可疑样本的一种有用技术是激光捕捉微切片技术(LCM)。激光捕捉微切片技术提供了一种选择需研究细胞的方法，并最小化由细胞种类的不均一性造成的易变性。因此，正常细胞和癌细胞之间的基因表达中度或细小的变化都可以被轻易检测到。在优选的方法中，样本包括从外周血中提取的循环系统上皮细胞。这可以按照多种方法获得，但最优化的方法是参考引用Immunivest公司的美国专利6,136,182所描述的磁性分离技术。一旦得到含有所关注细胞的样本，就提取其RNA，扩增得，并获得基因表达分布图，优选的通过微阵列获得合适组配的基因。确证基因表达分布的优选方法包括，确定一个能够编码蛋白质或肽的基因所产生的RNA的量。这可通过逆转录酶PCR(RT-PCR)，竞争性RT-PCR，实时RT-PCR，差异显示RT-PCR，Northern杂交分析和其他相关实验实现。当可能用单个PCR反应实施这些技术时，最好扩增来自mRNA的互补DNA(cDNA)或互补RNA(cRNA)并用微阵列对其分析。对本领域的技术人员来说大量不同的阵列构型及其生产方法是已知的，并且也在如下的美国专利中有描述5,445,934；5,532,128；5,556,752；5,242,974；5,384,261；5,405,783；5,412,087；5,424,186；5,429,807；5,436,327；5,472,672；5,527,681；5,529,756；5,545,531；5,554,501；5,561,071；5,571,639；5,593,839；5,599,695；5,624,711；5,658,734；和5,700,637；这些专利披露的技术在此引入作为参考。微阵列技术允许同时检测数千基因的稳定状态的mRNA水平，因此它为检测非控制的细胞增殖效果，如启动、抑制或调节等提供了一个强有力的工具。现在两种微阵列技术正被广泛使用。第一种是cDNA阵列，第二种是寡核苷酸阵列。尽管这些芯片在构造上存在差异，但其下游数据的分析和输出实质上是相同的。这些分析的结果典型地是对由标记探针获得的信号强度的测定，所述的探针用于检测与阵列上已知位点的序列杂交的、来自样品的cDNA序列。典型地，所述的信号强度与cDNA的含量，或者说样本细胞中所表达的mRNA的量成比例。有许多这样的技术可以获得并且是有用的。优选的检测基因表达的方法可以在美国专利中找到，如Linsley等人的专利6,271002；Friend等人的专利6,218,122；Peck等人的专利6,218,114；Wang等人的专利6,004,755，其所公开的内容均在此引入作为参考。基因表达水平的分析通过比较强度进行。最好是通过制备一种待测样品中基因表达强度相对于对照样品中基因表达强度的比值矩阵进行。例如，可以将疾病组织中基因表达的强度与相同类型正常组织中的表达强度进行比较(例如患病的结肠组织样本对正常的结肠组织样本)。这个表达强度的比值显示出被测样本和对照样本中基因表达的倍数变化。基因表达分布图也可以通过很多方法显示。最普遍的方法是用树突状图处理原始的荧光强度或矩阵系数，其中列表示被测样品，行表示基因。数据经这样的处理后那些具有相似表达分布的基因就会相互邻近。每个基因的表达比率可用一种颜色显示。例如，小于一的比率(表示下调)可以出现在图谱的蓝色部分，而大于一的比率(表示上调)可以出现在图谱的红色部分。商业上可购买到的计算机软件程序很适合显示这样的数据，包括Silicon Genetics有限公司的“GENESPRING”，Partek有限公司的“DISCOVERY”和“INFER”软件。用于本专利技术的方法的受调节基因如表1所示。患病细胞中差异表达的基因表现为上调或下调。上调和下调是相对的术语，表示可检测到的相对于某种基线的基因表达的量的差异(超出检测系统的噪音影响)。在这种情况中，基线是正常细胞测得的基因表达。再使用同样的测量方法确定患病细胞中所关注的基因相对于基线水平是上调或下调。上下文中，患病的，是指伴随细胞非控制增殖而出现的机体状态的改变，此种改变中断。扰乱，或潜在的打乱机体功能的适当表现。当某人基因型或表型的一些方面一致表现出存在特定疾病时，他就被诊断为患有该种疾病。作出诊断或预测的行为包括确定疾病表象/状态的情况，如治疗监测。在治疗监测中，比较经过一段时间治疗后的基因表达确定基因表达分布图是否有变化，或其变化与正常组织的模式更为一致来考虑本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种评估结肠直肠癌状况的方法，包括在选自Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．４２－４９的基因组合中鉴定每个基因（相对于正常种群的相同基因的表达）的差异调节。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：Y王，
申请(专利权)人：奥索临床诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]