用于鉴定牛脊椎畸形综合征携带者的遗传试验制造技术

本发明专利技术描述了用于鉴定脊椎畸形综合征（ＣＶＭ）疾病基因的牛携带者的遗传标记。该遗传标记包括小随体标记ＢＭ４１２９，ＩＮＲＡＡ００３，ＢＭＳ２７９０，ＩＬＳＴＳ０２９，ＩＮＲＡ１２３，ＢＭ２２０，ＨＵＪ２４６，ＢＭＳ８６２，ＢＭＳ９３７，ＢＬ１０４８，ＢＭＳ２０９５和ＢＭＳ１２６６以及牛ＳＬＣ３５Ａ３基因，它们位于牛染色体ＢＴＡ３上。牛ＳＬＣ３５Ａ３基因５５９位的Ｇ／Ｔ多态性被鉴定为牛ＣＶＭ的病因和诊断特征。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及在牛中发现的称为脊椎畸形综合征(CVM)的遗传性疾病。更具体的说，本专利技术涉及用于鉴定潜在的CVM牛携带者和用于鉴定CVM基因座及其负责牛脊椎畸形综合征的突变的分子标记。
技术介绍
脊椎畸形综合征(CVM)是在Holstein-Friesian(HF)黑白花奶牛中发现的先天性脊椎病症。该疾病在最近被描述(Agerholm等，2000)。在丹麦，至今(2000年10月17日)诊断的所有病例都在遗传上与以前的原种美国Holstein公牛Carlin-M IvanhoeBell有亲缘关系。根据现在的资料，CVM似乎是作为常染色体隐性疾病遗传的。该疾病的特征在于先天性远侧关节的两侧对称性关节弯曲和脊柱畸形，主要发生在颈-胸会合处，并伴随着体重下降(Agerholm等，1994)。在外表上，有下列主要发现在许多病例中，脊柱的颈部和/或胸部部分似乎缩短。经常发现中度的腕关节两侧对称性收缩和趾骨-掌骨关节(球节)严重收缩和旋后。还通常发现趾骨-跖骨关节的收缩和旋前及跗骨的轻微伸展。在大多数病例中观察到颈-胸会合处周围的脊柱路线不规则(irregular course)。可观察到脊柱侧凸，且在脊柱的其它区域存在病变。通常可通过对脊柱腹面的望诊和触诊识别这种路线不规则。然而，病变可最小且局限于两个或少数椎骨。在这种情况下脊柱可以是几乎正常的长度。因此，建议对脊柱进行放射学检查以排除疑似病例中的脊椎畸形。脊索具有正常的大小，位于椎管中，且没有明显的压迫。使用放射学可发现各种程度的由半脊椎畸形，融合和异形脊椎，脊柱侧凸和关节僵硬组成的脊椎畸形综合征。在取出椎弓后可最好地证实这点。在有些病例中，存在心脏畸形，主要表现为高度室间隔膜缺陷和右心室偏心肥大。可能出现大血管畸形。在肺部，存在胎儿肺膨胀不全。大多数在胸腔存在浆液出血性液体。已经观察到各种其它畸形，但是没有恒定的或者共有的发现。通常发现由难产引起的损伤。在流产的胎牛，早产牛犊和到期出生的死产牛犊中都观察到畸形。在较大的牛犊中尚未观察到这种情况。一般来说体重减小，且早产牛犊比到期出生的牛犊体重更低。另外，似乎在用携带者公牛的精子授精的母牛中流产频率增大。其原因至今还不清楚。目前，可用于CVM诊断的唯一工具是根据上述出现主要发生在颈-胸会合处的远侧关节的两侧对称性关节弯曲和脊柱畸形并伴随着体重下降的病理解剖诊断。然而，四肢的对称收缩是牛犊脊椎畸形中的常见和普遍发现。因此，存在鉴别诊断的问题，因为通常难以区分CVM和其它畸形。该遗传缺陷似乎通过已在全世界集中使用的公牛Carlin-MIvanhoe Bell传播的事实使得能够试验当前的和潜在的育种公牛是否是缺陷携带者具有重大的经济重要性。为了获得丹麦牛种群中潜在的CVM携带者动物的频率的估计量，本专利技术人从丹麦国家牛数据库提取了谱系信息。提取时(2000年10月)，登记有919，916头纯育母牛和小母牛，以及169，821头纯育公牛和雄性牛犊。在母牛和小母牛谱系中发现Bell707，915次，在雄性谱系中发现161，043次。在下面表1和2中，显示了谱系每代中Bell的出现数。表1丹麦Holstein母牛和小母牛谱系中Bell的出现次数世代NR 频率百分率 累计频率2212403.0212443202460 28.6 2237044321043 45.4 5447475133956 18.9 6787036273073.970601071869 0.3707879836 0.0707915表2丹麦Holstein公牛谱系中Bell的出现次数世代 频率百分率 累计频率2436 0.3 43632014412.52058048239451.210297454454527.71475196124557.7 15997471040 0.6 161014829 0.0 161043尽管这些数值也包括一些在谱系中出现两次和三次的Bell，但是该数据清楚地显示了大多数丹麦Holstein牛是潜在的CVM携带者。很明显，该问题在全球范围内是非常普遍的。因此，在牛工业中对于允许在各种品系的牛中鉴定潜在CVM携带者(例如，在可检测的临床症状出现前)的遗传学试验存在巨大的需求。在本专利技术之前，小随体(microsatellite)作图法尚未应用于未被分离或鉴定的引起上述脊椎畸形综合征的基因上。因此，就本专利技术人所知，在下面进一步详细描述的根据本专利技术的诊断方法以前尚未被提出或公开过。因此，包含CVM疾病基因座作图的本专利技术提供了以位于牛染色体BTA3上的小随体标记为基础的DNA试验。从下面的实施例显示出该试验确定Bell后代动物携带状况的能力已得到证实。专利技术概述在其最广义的方面，本专利技术提供了一种检测牛受试者中存在与牛脊椎畸形综合征(CVM)相关的遗传标记的方法，包括提供牛遗传物质，并检测该遗传物质中是否存在与牛脊椎畸形综合征疾病性状连锁的至少一种遗传标记或引起脊椎畸形综合征疾病性状的特定核苷酸多态性的步骤。在另一方面，本专利技术涉及用于检测牛受试者中存在与牛脊椎畸形综合征(CVM)相关的至少一种遗传标记的诊断试剂盒，包含选自由SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3，SEQ ID NO4，SEQ ID NO5，SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8，SEQ ID NO9，SEQ ID NO10，SEQ ID NO11，SEQ ID NO12，SEQ ID NO13，SEQ ID NO14，SEQ ID NO15，SEQ IDNO16，SEQ ID NO33，SEQ ID NO34，SEQ ID NO35，SEQ IDNO36，SEQ ID NO37和SEQ ID NO38及其组合组成的组中的至少一种寡核苷酸序列。另外，本专利技术涉及一种诊断方法，包括一种用于检测作为牛CVM病因和诊断特征的牛SLC35A3基因中的G/T多态性的诊断试剂盒。专利技术详细描述本专利技术的一个首要目的是使得能够鉴定携带牛脊椎畸形综合征(CVM)的牛。通过检测牛受试者中存在与牛CMV相关的遗传标记的方法来实现这点。更具体地说，该遗传标记可以是牛SLC35A3基因或甚至更具体地说是牛SLC35A3基因中的特定多态性。本文使用的术语“牛受试者”是指任何品种的牛。因此，任何各种母牛或公牛品种，无论雌雄，都包含在该术语中，且成年的和新生的动物都打算包括在内。该术语不指示具体年龄。牛受试者的一个例子是Holstein-Friesian牛种群中的一个成员。术语“遗传标记”是指存在于染色体上的牛基因组DNA中且用特定寡核苷酸可鉴定的可变核苷酸序列(多态性)。例如，这种可变核苷酸序列通过核酸扩增并观察由多态性引起的大小或核苷酸序列上的差异可进行辨别。在有用的实施方案中，该遗传标记可通过本领域的技术人员已知的各种技术进行鉴定，且包括通过包括限制性片断长度聚合酶链反应，等位基因特异性寡聚体杂交，寡聚体特异性连接试验，微型测序，直接测序，检测荧光的5’-核酸外切酶试验，和用PNA和LNA探针杂交等的方法进行的小随体或短串联重复(STR)的分类，限制性片断长度多态性(RFLP)，缺失或插入位点的检测，和本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测牛受试者中牛脊椎畸形综合征（ＣＶＭ）的方法，其中鉴定存在与牛脊椎畸形综合征（ＣＶＭ）相关的遗传标记，所述的方法包括：　　　　ａ）提供牛遗传物质，和　　　　ｂ）在所述的遗传物质中检测是否存在与牛脊椎畸形综合征疾病性状连锁的至少一个遗传标记。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：克里斯蒂安本迪克森，瑟伦斯文森，黑勒延森，弗兰克帕尼茨，安德斯奥斯博格，拉尔斯埃里克霍尔姆，佩尔霍恩，阿内特依霍伊，博汤姆森，梅特耶珀森，维维胡尼科克尼尔森，马蕾琼克，
申请(专利权)人：奥胡斯大学，畜牧饲养协会，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]