结肠直肠癌和其它胃肠病理学的非侵入性检测制造技术

本发明专利技术描述了一种在正常环境温度下分离存活的、生物学上基本纯的、脱落的粪便结肠细胞的方法。阐述了指示某种胃肠道状况的免疫粪便细胞和炎症细胞以及检测结肠直肠癌的一种非侵入性方法。详述了用于分离结肠细胞的运送和悬浮介质的组成。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
此申请是1999年4月15日提交的、未决的美国申请09/292,358的部分继续。
技术介绍
专利
本专利技术涉及分离的能够早期非侵入性检测结肠直肠癌和其它胃肠疾病的结肠细胞(colonocyte)。更为具体地，本专利技术涉及从少量粪便样品中获得的、生物学上基本纯的、起源于淋巴系统的分离活免疫粪便细胞(immunocoprocytes)与非上皮细胞。本专利技术还涉及提供用于在正常环境温度下从粪便样品中分离存活的结肠细胞的运送介质和分散或悬浮介质，以及使用本专利技术的分离结肠细胞进行结肠直肠与其它胃肠病理学检测的方法。所分离的结肠细胞还可用于其它异常的状况、症状、紊乱或病理状态的研究和测定。现有技术人类常见的一种胃肠道恶性肿瘤是结肠直肠癌。据估计，在美国结肠直肠癌占所有与癌症相关死亡男性和女性的14％，并且它的发病率仍就很高(Boring等人，加拿大临床癌症杂志(CA Cancer J.Clin.)1994；447-26)。如同其它恶性肿瘤的治疗一样，早期的检测对于这种癌症的成功治疗是至关重要的。目前，检测结肠和结肠直肠肿瘤的筛选检查方法基于使用(a)粪便潜血检验(FOBT)，(b)可弯曲的乙状结肠镜检查，(c)双对照钡灌肠法，和(d)结肠镜检查。在这些筛选检验中，只有FOBT是非侵入性的、简便且相对便宜，它的依据是相对高可能性的结肠直肠癌出血。然而，FOBT频繁的假阳性与假阴性结果很大程度上限制了它的特异性和灵敏度。其它的操作都是昂贵的，并且是侵入性的。因此，确实需要提供一种简便、非侵入性的、可信赖的并且不昂贵的方法来检测结肠直肠癌、胃肠(GI)道疾病和其它病理状态。结肠细胞是信息标志分子的一个重要来源，可提供受实验者胃肠道刚刚完成的代谢史景象。另外，这种细胞代表取自统计学大样本框的细胞群体，以非侵入性方式反映全长结肠上的结肠粘膜的状态，与使用涉及内窥镜检查的侵入性方法通过结肠活检的有限取样形成对照。结肠细胞经历某种变化或转化，携带指示结肠病理学包括癌前和癌的状况的某种生物或化学标志。因此，结肠细胞可以作为胃肠道中肿瘤过程发作和其它病理生理变化的有价值的早期指标。基因和表面蛋白的微妙变化是这种肿瘤标记的实例。特别是Ki67、肿瘤表面糖蛋白CD4和肿瘤相关抗原19-9以及外源凝集素结合都是胃肠道中肿瘤转化的特异生物标志。因为快速分裂的细胞中含有较多的DNA，所以分离的结肠细胞中的DNA数量与肿瘤的存在也有着密切的相关性。众所周知，结肠腺瘤息肉和癌的形成是一个涉及癌基因(ki-ras)激活、肿瘤抑制基因(p53和APC)失活、以及DNA错配修复基因变更的多步骤过程。迄今，在本专利技术所属的领域中通常认为，一旦结肠细胞脱落到粪便中，它们就会受到损害，其原因是它们一暴露到大气中细胞就开始破裂。粪便中的酶、粘液和细菌参与破坏结肠细胞的过程。例如，在美国专利#5,094,956、#5,380,647和#5,455,160中已经描述将新鲜收集的粪便样品冷冻到-20℃以下的温度，只是为保存化学成分，而没有考虑到细胞组分。因此，这些操作不保持细胞的完整性，不适于分离完整存活的、无其它杂质的细胞。Dutta和Nair(肠胃病学(Gastroenterology)，1141333-1335，1998)提及Albaugh等人(Int.J.Cancer，52347-350，1992)和Iyengar等人(FASEB J.52856-2859，1991)曾成功分离到存活的结肠细胞。Albaugh等人基于Iyengar等人的早期工作描述了一种运送介质和方法从粪便样品中获得结肠细胞。但是，现有技术的运送介质与本专利技术的运送介质不同，Albaugh等人的介质差不多是由盐溶液组成的，其中除无脂肪酸的BSA之外，还添加了抗生素。换句话说，现有技术中的运送介质至少缺少一种标准，即不含有粘液分解剂，而依照本专利技术，对于运送介质的配制它是绝对必需的。此外，在Albaugh等人的系统中，收集后的粪便样品在运送到实验室进行进一步研究时必须在冰中冷却，并且在冰中只能保存大约1小时。相反，本专利技术的系统不要求在冰中冷却，可在正常环境温度下完成所希望的结果，这是本专利技术的一个重要特征。而且，Albaugh等人声称尽管他们的细胞存活率超过80％，但不能排除吞噬细胞和其它细胞的存在。确实，Iyengar等人的图3和4中清楚地显示所得到的细胞制备物是相当不纯的。因此，Iyengar等人和Albaugh等人的方法可以提供存活的结肠细胞，但对于获得基本纯的结肠细胞这一目的，它们是不能胜任的。总之，到目前为止，还没有可能从少量的粪便物中，在正常的环境温度条件下，分离得到存活的、生物学上基本纯的特定细胞类型的样品。专利技术概述因此，本专利技术的一个目的是提供在正常环境温度下分离的存活的、生物学上基本纯的、脱落的粪便结肠细胞。本专利技术的另一个目的是提供存活的、分离的免疫粪便细胞。本专利技术的另一个目的是提供存活的、分离的淋巴或非淋巴谱系的炎症细胞。本专利技术的另一个目的是提供用于在正常环境温度下分离存活的脱落粪便结肠细胞的运送介质和分散或悬浮介质。本专利技术的另一个目的是提供一种依照本专利技术的讲授，利用在正常环境温度下分离的脱落粪便结肠细胞来检测胃肠道紊乱(包括结肠直肠癌)的非侵入性方法。本专利技术的多种其它目的和优势将从专利技术详述或附图简述中得到明确。附图简述参考附图将能更好地理解前述的和其它的目的、方面和优势，其中附图说明图1是在正常环境温度下从少量粪便材料样品分离存活的脱落结肠细胞的方法示意图；图2是依照本专利技术所分离结肠细胞经流式细胞仪分析的直方图资料，显示纯度超过96％；图3是根据免疫球蛋白特征确定的结肠细胞类别的示意图。专利技术详述本专利技术的多种目的和优势是通过在正常大气条件和环境温度下从粪便样品中分离得到活的、均一的期望细胞类型的结肠细胞而得以实现的。应当理解，除非另外定义，此处所使用的技术以及科学术语与本专利技术所属领域中普通技术人员通常所理解的含义相同。尽管与此处所描述的那些相似或等同的任何方法和材料都可用于本专利技术的实施和试验，但优选此处所描述的方法与材料。除非另外提及，此处使用的或考虑到的技术都是本领域普通技术人员熟知的标准方法。材料、方法和举例仅是示例性的并且没有限制性。此处使用的术语“基本上纯的”意味着本产品是均质或均一的一种类型，经流式细胞术或此处所描述的程序测定，其纯度大于96％，通常是98％-99％的纯度，并且没有物质干扰或其它类型细胞的污染。迄今，粪便材料中脱落的结肠细胞所遇的问题是那些细胞一旦暴露到正常的大气条件下，由于粪便材料中蛋白水解酶、微生物系统、粘液等的存在，就会遭到破坏。因此，必须设计一个系统来抑制所有那些阻碍在正常环境温度下从粪便材料中分离完整、存活结肠细胞的因素或要素的作用。这将通过本专利技术配制的两种不同介质得以实现(1)运送介质，和(2)分散或悬浮介质。运送介质是由生理盐水溶液组成，其中含有致酶失活量的捕酶剂或蛋白酶螯合剂(protease sequesteringagent)、足量的抑制细菌活性的杀菌剂或制菌剂，以及溶解粘液量的破坏粪便材料中粘液的试剂。本领域的普通技术人员可建议多种捕酶剂、制菌剂和粘液溶解剂，依照本专利技术的讲授，任何不干扰本专利技术目的的适当试剂都可用于配制运送介本文档来自技高网...

【技术保护点】
在正常环境温度下分离的、生物学上基本纯的、存活的、脱落粪便结肠细胞。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：帕德马纳班P奈尔，
申请(专利权)人：帕德马纳班P奈尔，
类型：发明
国别省市：US[美国]