α-突触核蛋白检测测定法和用于诊断α-突触核蛋白病的方法技术

提供了检测生物样品中α‑突触核蛋白聚集体存在的方法，其中将生物样品与反应样品混合以形成反应混合物，所述反应样品包含珠粒群体、适合于结合蛋白质聚集体并在与蛋白质聚集体结合时荧光增强的荧光团、和α‑突触核蛋白或其片段或变体，对反应混合物进行照射并同时以间歇式搅拌循环进行孵育，其中孵育期间反应混合物的荧光显著增加表明生物样品中存在α‑突触核蛋白聚集体。诊断α‑突触核蛋白病如帕金森病或路易体痴呆的方法。

Detection of alpha-synuclein and its application in diagnosis of alpha-synuclein disease

A method for detecting the presence of aggregates of alpha synuclein in biological samples is provided, in which biological samples are mixed with reaction samples to form a reaction mixture comprising bead populations, fluorescent groups suitable for binding protein aggregates and fluorescent enhancement when binding to protein aggregates, and alpha synuclein or its fragments or variants, and the reaction mixture is introduced. After irradiation and incubation with intermittent stirring cycle, the fluorescence of the reaction mixture increased significantly during incubation, suggesting the presence of alpha synuclein aggregates in biological samples. Diagnosis of alpha synuclein disease such as Parkinson's disease or dementia with Lewy bodies.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】α-突触核蛋白检测测定法和用于诊断α-突触核蛋白病的方法
本专利技术涉及用于检测生物样品中的聚集蛋白质的测定法，更具体地涉及用于检测生物样品中的聚集α-突触核蛋白的测定法。
技术介绍
α-突触核蛋白(a-syn)是一种140个氨基酸的非常保守的酸性小蛋白质，分子量为19kDa，其由位于4号染色体上的SNCA基因编码1。它以高浓度位于中枢神经系统的突触前神经末梢，在此其对突触小泡生物学发挥作用2。突触核蛋白病是一组与神经元和神经胶质的选择性群体中a-syn的纤维性聚集体的沉积有关的神经退行性病症。这些沉积物可见于神经胞体(如路易体(LB))中或如帕金森病(PD)或路易体痴呆(DLB)的疾病的营养不良神经突起中；或多系统萎缩症(MSA)的神经胶质细胞质包涵体中3。已经在如脑脊液(CSF)4和血清5的生物流体中检测到存在a-syn。已经提议将由ELISA测量CSF中的a-syn浓度作为用于与a-syn相关病症的生物标志物。然而，尽管许多研究表明在PD和DLB中CSFa-syn水平降低4,6，但是总体结果并不一致7。即使在已经证实CSFa-syn降低的那些研究中，差异虽很小8，但是在患者组内以及在患者组和对照组之间存在相当大的重叠。此外，已证明将实验室之间CSFa-syn测量标准化是困难的9。最近已经将a-syn的聚集特性与朊蛋白进行了比较，该朊蛋白的聚集会导致传染性海绵状脑病(TSE)10。实际上，目前文献有很多关于α-突触核蛋白病是否实际上是朊病毒样疾病的讨论11。已经将最近所描述的一种被称为实时震动诱导转换(RT-QuIC)的技术(该技术利用朊病毒蛋白诱导自聚集的能力)开发用于散发性克雅二氏症(sCJD)的诊断性CSF测试，该散发性克雅二氏症是最常见人类形式的TSE12。然而，鉴于朊病毒蛋白和a-syn之间的显著差异，这些技术未能以任何可靠的方式检测到生物样品中a-syn或a-syn聚集体的存在。因此，对于检测生物样品中a-syn和a-syn聚集体存在的可靠测定法仍然存在需求。本专利技术的至少一个目的是提供用于检测生物样品中a-syn和/或a-syn聚集体存在的改进的测定法。
技术实现思路
根据本专利技术的第一方面，提供了检测生物样品中α-突触核蛋白聚集体存在的方法，该方法包括以下步骤：(i)提供生物样品；(ii)提供反应样品，其包含珠粒群体、适合于结合蛋白质聚集体并在与蛋白质聚集体结合时荧光增强的荧光团、和α-突触核蛋白或其片段或变体；(iii)将生物样品和反应样品混合以形成反应混合物；(iv)以间歇式搅拌循环孵育反应混合物；(v)用激发反应样品荧光团的波长的光照射样品；和(vi)确定在孵育期间反应混合物的荧光水平，其中步骤(iv)至(vi)同时进行，并且在步骤(iv)至(vi)期间反应混合物的荧光显著增加表明在反应混合物中存在α-突触核蛋白聚集体，并且其中在反应混合物中存在α-突触核蛋白聚集体表明在生物样品中存在α-突触核蛋白聚集体。本领域技术人员将理解，术语“α-突触核蛋白(alpha-synuclein)”、“a-syn”、“α-突触核蛋白(α-synuclein)”和“α-syn”是指α-突触核蛋白，并且在全文中可互换使用。例如，在从人受试者获得生物样品的实施方式中，α-突触核蛋白是具有序列SEQIDNO.1的人α-突触核蛋白：SEQIDNO.1:参照α-突触核蛋白，术语“片段”旨在表示α-突触核蛋白序列的至少10个、20个、30个、50个、100个、120个、130个或140个或其之间任何整数的连续核苷酸的多核苷酸；优选的片段是在本专利技术方法的条件下能够聚集的那些片段。例如，片段可以包含天然α-突触核蛋白序列的氨基酸序列1-60或61-140。参照α-突触核蛋白，“变体”是指在肽或多肽序列中具有至少一个氨基酸取代、插入和/或缺失或具有对该蛋白质化学连接部分的改变的α-突触核蛋白。保守取代：具有相似生物化学性质的氨基酸残基的一个或多个氨基酸取代(例如，1个、2个、5个或10个残基)。通常，保守取代对所得肽或多肽的活性几乎没有影响。例如，α-突触核蛋白中的保守取代可以是基本上不影响肽在本专利技术方法的反应条件下聚集的能力的氨基酸取代。在一个具体的实施例中，α-突触核蛋白中的保守取代是不会显著改变蛋白质在本专利技术方法的反应条件下聚集的能力的氨基酸取代。可以将筛选α-突触核蛋白的变体用于鉴定哪些氨基酸残基可耐受氨基酸取代。在一个实施例中，α-突触核蛋白可以是人α-突触核蛋白，并且一个保守取代可以被包含在肽中，例如SEQIDNO:1中的保守取代。在另一个实施例中，10个或更少的保守取代可以被包含在肽中，如5个或更少。因此，本专利技术的肽或蛋白质可以包含1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个保守取代。通过采用例如标准方法(如定点诱变或PCR)操纵编码多肽的核苷酸序列，可以产生含有一个或多个保守取代的多肽。可替换地，通过采用肽合成方法(例如本领域已知的肽合成方法)，可以产生含有一个或多个保守取代的多肽。取代变体是其中已经将氨基酸序列中的至少一个残基除去并在其位置处插入不同残基的变体。可以取代蛋白质中的原始氨基酸并被认为是保守取代的氨基酸的实例包括：Ser取代Ala；Lys取代Arg；Gln或His取代Asn；Glu取代Asp；Asn取代Gln；Asp取代Glu；Pro取代Gly；Asn或Gln取代His；Leu或Val取代Ile；Ile或Val取代Leu；Arg或Gln取代Lys；Leu或Ile取代Met；Met、Leu或Tyr取代Phe；Thr取代Ser；Ser取代Thr；Tyr取代Trp；Trp或Phe取代Tyr；和Ile或Leu取代Val。在一个实施方式中，取代发生在Ala、Val、Leu和Ile之中；Ser和Thr之中；Asp和Glu之中；Asn和Gln之中；Lys和Arg之中；和/或Phe和Tyr之中。可以在其它地方，Ben-Bassat等人(J.Bacteriol.169:751-7,1987)、O'Regan等人(Gene77:237-51,1989)、Sahin-Toth等人(ProteinSci.3:240-7,1994)、Hochuli等人(Bio/Technology6:1321-5,1988)、WO00/67796(Curd等人)以及遗传学和分子生物学的标准教科书中发掘关于保守取代的其它信息。通常，α-突触核蛋白形成抗聚集的折叠的稳定四聚体。然而，已经被提出α-突触核蛋白的突变会促进聚集，并且α-突触核蛋白的这些聚集体是被认为与α-突触核蛋白病(如路易体痴呆和帕金森病)相关的原纤维的主要组成部分。因此，检测或确定生物样品是否包含α-突触核蛋白聚集体可以允许检测这类病变(pathology)而无需采用侵入性或昂贵的技术，并且可以允许可能存在这些病变之前采用标准方法对其进行检测。如实时震动诱导转化(RT-QuIC)的测定法迄今尚未能够检测到α-突触核蛋白聚集体的存在。本专利技术人惊奇地发现，本专利技术的经过改良RT-QuIC方法允许以非常高的敏感度和特异性检测α-突触核蛋白，并且允许将α-突触核蛋白聚集相关的病变与其它蛋白质聚集相关的病变区分开来。对于“荧光显著增加”，我们是指本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测生物样品中α‑突触核蛋白聚集体存在的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供生物样品；(ii)提供反应样品，所述反应样品包含珠粒群体、适合于结合蛋白质聚集体并在与蛋白质聚集体结合时荧光增强的荧光团、和α‑突触核蛋白或其片段或变体；(iii)将所述生物样品和所述反应样品混合以形成反应混合物；(iv)以间歇式搅拌循环孵育所述反应混合物；(v)用激发所述反应样品的所述荧光团的波长的光照射所述样品；和(vi)确定在孵育期间所述反应混合物的荧光水平，其中步骤(iv)至(vi)同时进行，并且在步骤(iv)至(vi)期间所述反应混合物的所述荧光显著增加表明在所述反应混合物中存在α‑突触核蛋白聚集体，并且其中在所述反应混合物中存在α‑突触核蛋白聚集体表明在所述生物样品中存在α‑突触核蛋白聚集体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.07 GB 1611840.81.一种检测生物样品中α-突触核蛋白聚集体存在的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供生物样品；(ii)提供反应样品，所述反应样品包含珠粒群体、适合于结合蛋白质聚集体并在与蛋白质聚集体结合时荧光增强的荧光团、和α-突触核蛋白或其片段或变体；(iii)将所述生物样品和所述反应样品混合以形成反应混合物；(iv)以间歇式搅拌循环孵育所述反应混合物；(v)用激发所述反应样品的所述荧光团的波长的光照射所述样品；和(vi)确定在孵育期间所述反应混合物的荧光水平，其中步骤(iv)至(vi)同时进行，并且在步骤(iv)至(vi)期间所述反应混合物的所述荧光显著增加表明在所述反应混合物中存在α-突触核蛋白聚集体，并且其中在所述反应混合物中存在α-突触核蛋白聚集体表明在所述生物样品中存在α-突触核蛋白聚集体。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品是体液样品。3.根据权利要求2所述的方法，其中所述体液选自包括脑脊液、血液或血液成分、鼻部液体或组织、尿液、粪便和淋巴的组。4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应样品是经过缓冲的反应样品。5.根据权利要求4所述的方法，其中将所述反应样品缓冲以维持所述反应样品的pH在约pH6至约pH8.5。6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述蛋白质聚集体包含显著含量的β-折叠。7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述荧光团是硫黄素或花青T-284。8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应样品包含约0.01mg/mL的α-突触核蛋白至约10mg/mL的α-突触核蛋白以充当聚集底物。9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应样品的所述α-突触核蛋白是全长α-突触核蛋白的片段。10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应样品中所述珠粒群体的所述珠粒包括氧化锆，二氧化硅，玻璃，石英或聚合物，如聚苯乙烯，聚四氟乙烯(PTFE)，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，或其组合。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述珠粒群体的所述珠粒包括氧化锆、二氧化硅或玻璃。12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾莉森·格伦，格雷厄姆·费尔佛欧，
申请(专利权)人：爱丁堡大学管理处，
类型：发明
国别省市：英国,GB