附着软骨细胞的多孔质体的长期保存方法技术

本发明专利技术揭示了一种在密封状态下至少在14天内长期保存附着软骨细胞的多孔质体的方法。该方法具备以下部分：将分离了的软骨细胞以1.0×107个细胞/ml～1.0×108个细胞/ml的给与细胞浓度悬浊于去端肽胶原液中制备细胞悬浊液，将上述细胞悬浊液接种在具备生物体适宜性的多孔质体上，使上述细胞悬浊液在上述多孔质体中凝胶化得到附着软骨细胞的多孔质体，将上述附着软骨细胞的多孔质体在给与活细胞数量每1mL为1.0×105个细胞以上的量的含有胰岛素、成纤维细胞生长因子以及5％以上的血清的培养基中，以培养基的振荡速度在大于0cm/秒且在2.8cm/秒以下的范围内的方式进行振荡的同时，维持26～37℃。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种长期保存附着软骨细胞的多孔质体的保存方法。
技术介绍
专利文献I中，揭示了将培养软骨细胞而得的培养软骨组织使用磷酸缓冲液、林格氏(Riger，日文:U ^ )类保存液、或者生理盐水等等渗压盐类溶液在2~25°C下保存10天的方法。专利文献2中，揭示了一种将细胞浸溃于细胞保存液中的细胞保存方法，该方法对相邻的2个细胞集合体的旋转速度进行测定，基于该旋转速度使细胞保存液的能量源浓度或量不同，维持细胞活性的同时使细胞增殖能力钝化。 专利文献I 中记载的方法以在运输期间所需的保存(10天左右)为目的，并非为了药典中规定的无菌试验所要求的14天期间的保存。专利文献2中，相邻2个细胞集合体的旋转速度以处于维持细胞活性的同时使细胞增殖能力钝化的范围中的条件下使细胞保存液的能量源或量不同，因此在不能交换培养基的状況下不能采用。现有技术文献专利文献专利文献1:日本专利特开2005-95152号公报专利文献2:日本专利第4230750号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的技术问题本专利技术的技术问题是，提供一种不需要交换培养基而长期保存附着软骨细胞的多孔质体的方法。解决技术问题所采用的技术方案为了解决上述问题，本专利技术是一种在密封状态下至少在14天内长期保存附着软骨细胞的多孔质体的方法，其特征在于，具备以下部分:将分离了的软骨细胞以1.0X IO7个细胞/ml~1.0 X IO8个细胞/ml的给与细胞浓度悬浊于去端肽胶原中制备细胞悬浊液，将上述细胞悬浊液接种在多孔质体上，使上述细胞悬浊液在上述多孔质体中凝胶化得到附着软骨细胞的多孔质体，将上述附着软骨细胞的多孔质体在给与活细胞数量每ImL为1.0X IO5个细胞以上的量的含有胰岛素、成纤维细胞生长因子以及5%以上的血清的培养基中，以培养基的振荡速度在大于Ocm/秒且在2.8cm/秒以下的范围内的方式进行振荡的同时，维持26~37。。。专利技术的效果根据本专利技术，能够不需要交换培养基而长期保存附着软骨细胞的多孔质体。藉此，可通过无菌实验确认附着软骨细胞的多孔质体的无菌状态。此外根据本专利技术，在长期保存中能够防止多孔质体上附着的软骨细胞的过量增殖。进一步，由于在长期保存后的死细胞数量少，因此能够提供即使在长期保存后也处于适宜移植的状态的附着软骨细胞的多孔质体。因此，可提供一种在与目前相比在长期中，如日本药典规定的无菌实验期间，即14天内不交换培养基的附着软骨细胞的多孔质体保存方法。此外，即使在根据法律没有保存14天的义务的国家或地区里，预计从制造附着软骨细胞的多孔质体到提供给患者移植机构为止会有一定的时间差，在该期间里也可将软骨细胞至少安全地保存14天。【附图说明】图1是表示附着了耳廓软骨细胞的多孔质体的制造工序的流程图。图2是表示向多孔质体给与含有去端肽胶原的细胞悬浊液的状态的示意图。图3是表示在密闭容器内保存细胞附着多孔体的状态的示意图。图4是表示长期保存细胞附着多孔体的状态的示意图。图5是表示由保存温度产生的保存中的细胞生存率差异的图。图6是表示在特定的保存温度下细胞生存率没有差异的图。【具体实施方式】(I)附着软骨细胞的多孔质体的制造以及保存的概要本说明书中，也将“附着软骨细胞的多孔质体”称为“细胞附着多孔质体”。使用图1对细胞附着多孔质体的制造工序的概况进行说明。首先，从对象上采集软骨。对得到的软骨通过例如胶原酶处理等进行酶处理，分离软骨细胞。接着将其以1.0X IO7个细胞/mL~1.0X IO5个细胞/mL的浓度悬浊于2~3%的去端肽胶原溶液中。将得到的细胞悬浊液接种在多孔质体上。接着，例如，通过在37°C的恒温箱内静置2小时，利用将去端肽胶原进行凝胶化的方式在多孔质体上固定细胞。藉此得到细胞附着多孔质体。细胞附着多孔质体在对象上进行移植来使用。因此，在移植之前，需要对制作的细胞附着多孔质体进行试验确认无菌。无菌试验中，对于I个批次，制作来源于相同软骨的多个细胞附着多孔质体，对该批次所包括的一部分细胞附着多孔质体进行无菌试验。将没有用于无菌试验的细胞附着多孔质体，与接受无菌试验的细胞附着多孔质体一起密封保存在密闭容器中。至少在无菌试验的期间内维持密封保存。密封保存通过以下方式进行:将细胞附着多孔质体在给与活细胞数量每ImL为1.0X IO5个细胞以上的量的含有胰岛素、成纤维细胞生长因子以及5%以上的血清的保存用培养基中，以以下方式进行振荡的同时，维持26~37°C ;该振荡方式为:振荡振幅为直线的情况下至少在一个方向上为IOmm~50mm、圆方向的情况下其直径也为IOmm~50mm、振荡速度在15rpm~90rpm的范围内。通过无菌试验确认该批次无菌之后，将密封保存的细胞附着多孔质体用于移植。(2)细胞附着多孔质体细胞附着多孔质体包括多孔质体和固定于多孔质体的表面以及孔的内面的软骨细胞。(3)分离细胞如下制备分离细胞。首先，采集软骨细胞，例如耳廓软骨细胞。接着从所采集的软骨细胞去除脂肪、血管以及血液等。将其切碎。进一步，通过酶，例如胶原酶溶液进行消化，得到分离细胞。在使用分离细胞制备细胞附着多孔质体前，可将分离细胞接种于有明胶涂层的培养皿或有明胶涂层的烧瓶中，通过以例如胰蛋白酶等酶进行消化回收，实施原代培养以及传代培养。用于原代培养以及传代培养的增殖培养基，其基础培养基如DMEM/F12或者MEM中含有抗生素，例如，青霉素以及链霉素。如下进行将分离细胞固定于多孔质体，制备细胞附着多孔质体的工序。将分离了的细胞悬浊于去端肽胶原液中得到细胞悬浊液。去端肽胶原液含有去端肽胶原，基础培养基如MEM、DMEM/F12，和抗生素如青霉素以及链霉素。在例如半圆柱状的多孔质体中添加细胞悬浊液。可通过如图2所示的，从所需大小的多孔质体21的上方，利用移液管23给与细胞悬浊液22的方式向多孔质体添加细胞悬浊液。给与多孔质体的细胞悬浊液可以1.0X IO7个细胞/mL~1.0X IO8个细胞/mL的浓度含有细胞。 多孔质体可以是具备生物体适宜性的多孔质材料，例如聚乳酸。多孔质体的体积可根据所要移植的部位決定。多孔质体的气孔率为85~90%，平均孔径约400 μ m。对给与了细胞的多孔质体，通过在37°C的具有足够湿度的环境下，例如在放入盖上盖子的培养皿中的状态下静置于37°C的恒温箱内维持约2小时的方式，将去端肽胶原凝胶化。通过去端肽胶原的凝胶化将细胞悬浊液凝胶化，藉此将细胞固定于多孔质体的表面以及孔的内面，得到细胞附着多孔质体。此外，去端肽胶原液的凝胶化也可如下进行:例如，将IOmL的在基础培养基如MEM、DMEM、DMEM/F12或DMEM/F12中加入了抗生素如青霉素以及链霉素的培养基放入直径9cm的培养皿内，在该培养皿内设置载放多孔质体的台，在该台上，以不浸没并从培养基中露出的状态载放给与了细胞的多孔质体，在培养皿的盖上盖子的状态下，例如在37°C的恒温箱内培养2小时。(4)密封保存密封保存示于图3。首先，准备灭菌了的密闭容器30。该密闭容器30具备在开口缘部的外面进行螺纹加工的单密封筒体31，和在开口缘部的内面进行螺纹加工、螺合于单密封筒体31的螺纹部的盖子32。接着，在单密封筒体31的内部收容保存用培养基33。然后，在单密封筒体31的内部收纳细胞附着本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在密封状态下至少在14天内长期保存附着软骨细胞的多孔质体的方法，其特征在于，具备以下部分：将分离了的软骨细胞以1.0×107个细胞/ml～1.0×108个细胞/ml的给与细胞浓度悬浊于2～3％去端肽胶原中制备细胞悬浊液，将所述细胞悬浊液接种在具备生物体适宜性的多孔质体上，使所述细胞悬浊液在所述多孔质体中凝胶化而得到附着软骨细胞的多孔质体，将所述附着软骨细胞的多孔质体在给与活细胞数量每1mL为1.0×105个细胞以上的量的含有胰岛素、成纤维细胞生长因子以及5％以上的血清的培养基中，以培养基的振荡速度在大于0cm/秒且在2.8cm/秒以下的范围内的方式进行振荡的同时，维持26～37℃。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.12.01 JP 2011-2638371.一种在密封状态下至少在14天内长期保存附着软骨细胞的多孔质体的方法，其特征在于，具备以下部分: 将分离了的软骨细胞以1.0X 107个细胞/ml~1.0X 108个细胞/ml的给与细胞浓度悬池于2~3%去端肽胶原中制备细胞悬池液， 将所述细胞悬浊液接种在具备生物体适宜性的多孔质体上， 使所述细胞悬浊液在所述多孔质体中凝胶化而得到附着软骨细胞的多孔质体， 将所述附着软骨细胞的多孔质体在给与活细胞数量每1mL为1.0X 105个细胞以上的量的含有胰岛素、成纤维细胞生长因子以及5%以上的血清的培养基中，以培养基的振荡速度在大于0cm/秒且在2.8cm/秒以下的范围内的方式进行振荡的同时，维持26~37°C。2.如权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：原井基博，馆山俊晶，
申请(专利权)人：富士软件株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP