一种胶原基质软骨修复膜、制备方法及应用技术

本发明专利技术公开一种胶原基质软骨修复膜的制备方法，包括以下步骤：（1）以猪腿肌腱为原料，经剪切、酶解、离心、过滤、溶解，得到Ⅰ型胶原溶液；（2）用1M碳酸氢钠溶液对步骤（1）得到的Ⅰ型胶原溶液进行中和；（3）将步骤（2）中中和后的Ⅰ型胶原溶液倒入模具，于30~40℃干燥35~54h，在模具内形成Ⅰ型胶原基质膜；（4）将步骤（3）得到的Ⅰ型胶原基质膜浸泡于20~200ug/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于30~40℃孵育0.5~2h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原基质软骨修复膜。本发明专利技术还公开了一种胶原基质软骨修复膜及其应用。本发明专利技术的软骨修复膜对软骨损伤面有一定的粘附性，适宜软骨损伤修复。

【技术实现步骤摘要】
—种胶原基质软骨修复膜、制备方法及应用
本专利技术涉及生物材料制备领域，特别涉及一种含活性因子的胶原基质软骨修复膜的快速制备方法与应用。
技术介绍
关节软骨能减少相邻两骨间的摩擦，缓冲运动时产生的震动，所以由体育运动造成的软骨损伤极为普遍。有数据表明，单美国的软骨相关手术每年就有超过40万例。由于软骨无血管、无神经，传统观点认为软骨损伤无法自发修复，如果不采取外加手段干预治疗，会导致进一步的软骨磨损，甚至引发骨关节炎，对其结构和功能造成不可逆的损害，严重影响患者的生活工作质量。目前临床治疗表层软骨损伤的保守治疗方法包括关节腔灌洗清创术，微骨折术等只能减轻关节疼痛和暂时缓解临床症状，并不能有效地促进软骨组织的修复再生，阻止病程的发展。因此，寻找新型的、可有效促进软骨生理性再生修复的方法具有极其重要的临床意义。 近年来，随着组织工程和再生医学技术的不断成熟，为提高软骨的修复质量带来崭新的机会。天然生物材料I型胶原，由于其免疫原性低，生物相容性好，降解速率可控等优点，被广泛用于软骨组织工程支架的制备。如德国Arthro Kinetics公司的CaReS产品是由鼠尾I型胶原构成的3D支架，用于治疗3.5-14 cm2大小的软骨缺损；中国专利技术专利(ZL200710068762.5 ) “一种软骨组织工程支架及其应用”中，用I型胶原构建含有致密层与疏松层的双层海绵支架，用于骨软骨损伤修复。 此外，有研究者发现软骨修复过程中会出现软骨钙化的迹象。软骨钙化一般发生于生理性生长板软骨内骨化过程，在此过程中，软骨细胞肥大、软骨基质矿化、降解，骨基质增多，钙化层上移，双重潮线出现，最终导致关节面受力改变，软骨结构和功能受损甚至骨关节炎的发生。 甲状旁腺激素相关肽(PTHrP)是甲状腺激素家族中的一员，作为钙化抑制因子参与生长板发育过程。甲状旁腺激素相关肽由173个氨基酸组成，其活性片段1-34与甲状旁腺激素(PTH) —致。美国礼来制药研发的药物特立帕肽(商品名Forteo)为人重组蛋白PTH(1-34)，用于有骨折高发风险的绝经后妇女骨质疏松症的治疗。
技术实现思路
本专利技术是提供一种胶原基质软骨修复膜的制备方法，预先制备的胶原基质膜可在使用时与活性因子PTHrP (1-34)(甲状旁腺激素相关肽)迅速复合，保证了甲状旁腺激素相关肽的生物活性，其可以解决现有技术中的软骨修复过程中会出现软骨钙化的缺点。 本专利技术采用的技术方案是:一种胶原基质软骨修复膜的制备方法，包括以下步骤:(1)以新鲜猪腿肌腱为原料，经剪切、酶解、离心、过滤、溶解，获得I型胶原溶液；(2)用IM碳酸氢钠溶液对步骤(I)得到的5?20 mg/mL I型胶原溶液进行中和；(3)将步骤2得到的中和后的I型胶原溶液倒入模具，于3(T40°C干燥48h，在模具内形成I型胶原基质膜；(4)手术前，将步骤3得到的I型胶原基质膜浸泡于2(T200 ug/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于3(T40°C孵育0.5?2h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的I型胶原基质膜材料。 进一步，步骤(I)所述I型胶原溶液的制备方法为:A)从二月龄健康白猪猪腿处剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪碎浸泡于体积浓度75%的乙醇水溶液中，4 °C过夜；B)将步骤A的肌腱碎片用蒸馏水冲洗5遍，加入0.5mol/L的乙酸水溶液中，调节pH至I，加入胃蛋白酶，4 °C放置3天，获得胶原溶胶液；所述乙酸水溶液的体积用量以肌腱碎片质量计为18.9mL/g，所述胃蛋白酶质量用量以肌腱碎片质量计为94.7mg/g ;C)将步骤B获得的胶原溶胶液于4°C、4000rpm水平离心25分钟，弃上层脂肪层，将沉淀a用0.5mol/L乙酸水溶液稀释3倍体积，在超净台中用4层纱布过滤，将滤液与0.9mol/L的NaCl水溶液以体积比1:10混合，间歇震荡，4 °C过夜，再在4 °C、4000rpm水平离心25分钟，弃上清液及悬浮物，获得沉淀b ;D)将沉淀b按下述方式之一处理，制备水溶性I型胶原:a )将沉淀b用0.5mol/L的乙酸水溶液在4 1:溶解过夜，所述乙酸水溶液与沉淀b的体积比为4:1，获得所述水溶性I型胶原；b )将沉淀b置于直径0.25 μ m的再生纤维素透析袋中，以三蒸水作为透析液，每天换水Γ 6次，透析3天，将透析袋中透析后的沉淀置于培养皿中-80 °C过夜，再于冻干机中抽干2?3天，获得所述水溶性I型胶原。 进一步，步骤(2)中，用IM碳酸氢钠溶液对步骤(I)得到的I型胶原溶液进行中和，其中I型胶原溶液的浓度为10 mg/mL。 进一步，步骤(2)所述碳酸氢钠溶液与I型胶原水溶液的体积比是广4:1。 进一步，步骤(2)所述碳酸氢钠溶液与I型胶原水溶液的体积比是2.3:1。 进一步，步骤(3)所述模具可以为表面平整光滑的各种形状、各种材质的模具，通常采用塑料材质的方形皿、圆形皿或孔板容器。 进一步，步骤(4)所述甲状旁腺激素相关肽溶液选用商品化的人重组蛋白甲状旁腺激素相关肽粉末配制。 进一步，步骤(4)所述甲状旁腺激素相关肽溶液由灭菌PBS缓冲液(pH=7.4)配制成的水溶液。 进一步，步骤(4)所述甲状旁腺激素相关肽溶液的体积用量是I型胶原基质膜体积的10?20倍。 本专利技术还公开了一种胶原基质软骨修复膜，其通过上述制备方法制备得到。 本专利技术还公开了胶原基质软骨修复膜在制备软骨损伤的修复治疗或联合其他全层软骨损伤或骨软骨损伤修复治疗的支架材料中的应用。 本专利技术所述的软骨修复膜，颜色半透明、表面光滑，对软骨损伤面有一定的粘附性，适宜软骨损伤修复。 本专利技术所述的软骨修复膜，制备工艺中不接触有毒物质，未使用变性剂、促凝剂和交联剂等添加剂。 本专利技术所述的软骨修复膜，制备工艺简单，手术操作前将预先制备的胶原基质膜在使用前与甲状旁腺激素相关肽溶液复合，避免预先复合甲状旁腺激素相关肽溶液的支架灭菌时造成的活性因子失活，最大程度保证了甲状旁腺激素相关肽溶液的生物活性。 本专利技术所述的软骨修复膜，I型胶原基质膜可以有效的缓释甲状旁腺激素相关肽，因而能够抑制软骨钙化，从而提高软骨损伤的修复质量。 【附图说明】 图1实施例3中新西兰大白兔软骨损伤造模照片及修复6周后的结果。图1A为新西兰大白兔造模为4_X4_的表层软骨缺损，图1B为软骨修复膜，图1C为修复6周空白对照组大体图片，图1D为修复6周软骨修复膜组大体图片。 图2实施例9中新西兰大白兔软骨损伤修复6周后的组织学结果。图2A为4倍镜下空白对照组SO染色图片，图2B为4倍镜下软骨修复膜组SO染色图片，图2C为40倍镜下软骨修复膜组SO染色图片。 【具体实施方式】:下面结合【具体实施方式】，详细描述本专利技术。应理解，这些实施方式仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。 实施例1:A)从二月龄健康白猪猪腿处剥取肌腱，去除筋膜和脂肪，剪碎120g，浸泡于500mL体积浓度75%的乙醇水溶液中，4 °C过夜；B)将步骤A的肌腱碎片95g用蒸馏水冲洗5遍，力口入0.5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以猪腿肌腱为原料，经剪切、酶解、离心、过滤、溶解，得到Ⅰ型胶原溶液；（2）用1M碳酸氢钠溶液对步骤（1）得到的Ⅰ型胶原溶液进行中和；（3）将步骤（2）中中和后的Ⅰ型胶原溶液倒入模具，于30~40℃干燥35~54h，在模具内形成Ⅰ型胶原基质膜；（4）将步骤（3）得到的Ⅰ型胶原基质膜浸泡于20~200 ug/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于30~40℃孵育0.5~2h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的Ⅰ型胶原基质软骨修复膜。

【技术特征摘要】
1.一种胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)以猪腿肌腱为原料，经剪切、酶解、离心、过滤、溶解，得到I型胶原溶液； (2)用IM碳酸氢钠溶液对步骤(I)得到的I型胶原溶液进行中和； (3)将步骤(2)中中和后的I型胶原溶液倒入模具，于3(T40°C干燥35飞4h，在模具内形成I型胶原基质膜； (4)将步骤(3)得到的I型胶原基质膜浸泡于2(T200ug/mL甲状旁腺激素相关肽溶液中，于3(T40°C孵育0.5?2h，得到复合甲状旁腺激素相关肽的I型胶原基质软骨修复膜。2.根据权利要求1所述的胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中I型胶原溶液的浓度为5?20 mg/mL。3.根据权利要求1所述的胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中干燥的温度为37°C，且干燥的时间为48h。4.根据权利要求1所述的胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中I型胶原基质膜在甲状旁腺激素相关肽溶液中孵育的温度3(T40°C，且孵育的时间为0.5?2h。5.根据权利要求1至4任意一项所述胶原基质软骨修复膜的制备方法，其特征在于，步骤(I)中剪切为将猪腿肌腱去除筋膜和脂肪，剪切成肌腱碎片，并浸泡于75%的乙醇中。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：张薇，谢淑君，陈隆坤，
申请(专利权)人：浙江星月生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33