利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方法技术

本发明专利技术提供一种利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，包括：从新鲜牛眼球上切取角膜片后，并角膜片浸泡在低渗溶液中；由角膜片上得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，将其反复冻融，以使细胞破碎；依次采用缓冲液对牛角膜基质进行漂洗、以及将其放入脱细胞试剂中进行浸泡后，采用超纯水对其进行冲洗；将牛角膜基质放入另一种脱细胞试剂中进行浸泡后，再次采用超纯水对牛角膜基质进行冲洗；将牛角膜基质放入脱水剂中进行浸泡后，采用钴-60对牛角膜基质进行辐照后，将所制备的牛角膜基质放干燥保存。本发明专利技术采用物理方法与低毒性试剂，且时间极短，所得到的牛角膜基质保存完整，具有透明性好、结构致密的特点，接近于人体角膜的自然特性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种牛角膜基质的制备方法，尤其是一种利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方法。
技术介绍
角膜疾病是全球第四大致盲病患，据世界卫生组织数据，全球范围内，角膜疾病是仅次于白内障、青光眼、老年性黄斑部病变的第四大致盲病患，约占5.1％。2006年《第二次全国残疾人抽样调查统计结果》表明，因角膜病致盲患者约400万人，且每年新增10多万患者，其中约200万可以通过角膜移植手术复明，但每年施行的角膜移植手术例数为4000-5000例，大量患者因没有供体来源而失明，约300万患者在“等米下锅”，而不准用死刑犯人遗体的规定让角膜的供给大幅下降，每年排队等待角膜供体的患者数量还会大幅增加。由此可见，构建人工角膜是中国目前的当务之急。近年来，组织工程角膜技术的发展为角膜移植带来了希望，但理想的牛角膜基质支架仍然是角膜体外重建的研究热点和技术难点。在角膜载体支架方面，虽然国内外学者对羊膜、异种脱细胞猪角膜基质等天然生物材料和复合材料进行了大量的试验研究，但真正能满足临床要求的载体支架还是空白，已报道的异种(如猪角膜基质)经脱细胞处理后所形成的支架也存在着结构破坏严重、透明度低、弹力差等致命缺陷。而且制备脱细胞牛角膜基质过程中使用胰酶、乙二胺四乙酸溶液及聚乙二醇辛基苯基醚、十二烷基硫酸钠等去垢剂，对基质中胶素蛋白等天然生物大分子制成的膜片有很大的破坏作用，而临床报道中移植后的角膜呈明显的不透明状也印证了这种材料的缺陷，并不能临床应用。由此可见，制备出一种透明性好、结构致密、与人角膜细胞相容性好的基质材料是角膜临床应用的关键难题。由此可见，制备出一种透明性好、结构致密、与人角膜细胞相容性好的基质材料是角膜临床应用的关键难题。
技术实现思路
针对上述问题中存在的不足之处，本专利技术提供一种透明性好、结构致密、与人角膜细胞相容性好的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法及应用方法。为实现上述目的，本专利技术提供一种利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，包括以下步骤：从新鲜牛眼球上切取角膜片后，并将角膜片浸泡在低渗溶液中；由角膜片上得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，将其反复冻融，以使细胞破碎；依次采用缓冲液对牛角膜基质进行漂洗、以及将其放入脱细胞试剂中进行浸泡后，采用超纯水对其进行冲洗；将牛角膜基质放入另一种脱细胞试剂中进行浸泡后，再次采用超纯水对牛角膜基质进行冲洗；将牛角膜基质放入脱水剂中进行浸泡后，采用钴-60对牛角膜基质进行辐照后，将所制备的牛角膜基质放干燥保存。上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，上述方法的具体步骤如下：S1、取12小时内的新鲜牛眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环钻切取200～500微米的角膜片，将其放于低渗溶液中浸泡30～60分钟；S2、用手术刀刮掉角膜片的上皮层，保留前弹力层，撕掉后弹力层和内皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，将其反复冻融使细胞破碎；S3、依次采用缓冲液对牛角膜基质漂洗2～3次、以将其放入脱细胞试剂浸泡15～90分钟，再采用超纯水对其进行冲洗2～3次；S4、将牛角膜基质放入另一种脱细胞试剂浸泡15～30分钟后，再采用超纯水对其进行冲洗2次；S5、将牛角膜基质放入脱水剂中进行浸泡3～6小时后，采用剂量为5～15KGy的钴-60对牛角膜基质辐照1～5小时后，将所制备的牛角膜基质放置于无水氯化钙中干燥保存。上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，在步骤S1中，低渗溶液为浓度为0.3％～0.5％的NaCl溶液。上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，在步骤S2中，将牛角膜基质冷冻1或3小时，并解冻15～60分钟，以使牛角膜基质的细胞破碎。上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，在步骤S3中，缓冲液为100mmTris-HCl缓冲液，其pH值为7.5；脱细胞试剂采用浓度为3-5g/L的碳酸氢钠溶液。上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，在步骤S4中，另一种脱细胞试剂采用浓度为0.6‰～1.8‰的次氯酸钠溶液。上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，在步骤S5中，脱水剂采用体积比为70％或80％的甘油脱水剂。上述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其中，在步骤S5中，将牛角膜基质放于质量指标符合HG/T2765-2005标准的硅胶干燥剂中干燥保存。本专利技术还提供一种利用新鲜牛角膜以制备的牛角膜基质的应用方法，在对牛角膜基质应用前采用PBS浸泡10分钟复水后，即可在手术中使用。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：本专利技术通过反复冻融与两种脱细胞试剂交替使用的方法，逐步去除牛角膜基质中免疫原细胞成分和可溶性蛋白，从而得到无排异的脱细胞牛角膜基质，干燥后储存，使用前用PBS浸泡10分钟复水后即可手术。本专利技术采用物理方法与低毒性试剂，且时间极短，所得到的牛角膜基质保存完整，安全性高、无抗原性，接近于人体角膜的自然特性。本专利技术具体成本低、工艺简单、操作时间短、便于保存等特点，有利于工业化生产和临床应用。附图说明图1与图2为本专利技术的脱细胞牛角膜基质一实施例的脱细胞处理前后的HE染色对比照片，其中，图1为脱细胞前，图2为脱细胞后；图3为成品脱细胞牛角膜基质片的照片；图4与图5为本专利技术的脱细胞牛角膜基质在进行动物实验手术移植后的照片，图4为手术移植一周后，图5为手术移植一个月后；图6与图7为本专利技术的脱细胞牛角膜基质在进行临床试验手术移植前后的对比照片，其中，图6为手术移植一周后，图7为手术移植一个月后。具体实施方式实施例1本专利技术提供一种利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，包括以下步骤：S1、取不超过8小时内采取的新鲜牛眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环钻切取200微米的角膜片，放入浓度为0.6％的NaCl低渗溶液中30分钟。S20、用手术刀刮掉角膜上皮层，保留前弹力层，操作时手法轻柔，刮到前弹力膜层为止。在手术剪刀帮助下，撕掉后弹力层和内皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质。将牛角膜基质片放置在装有PBS的50ml冻存管中，在-80℃冰箱中冻1小时后，于37℃融化15分钟，反复冻融3次进行细胞破壁，以使牛角膜基质片的细胞破碎。S3、采用100mmTris-HCl缓冲液(pH值为7.5)漂洗3次，且每次漂洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，包括以下步骤：从新鲜牛眼球上切取角膜片后，并将角膜片浸泡在低渗溶液中；由角膜片上得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，将其反复冻融，以使细胞破碎；依次采用缓冲液对牛角膜基质进行漂洗、以及将其放入脱细胞试剂中进行浸泡后，采用超纯水对其进行冲洗；将牛角膜基质放入另一种脱细胞试剂中进行浸泡后，再次采用超纯水对牛角膜基质进行冲洗；将牛角膜基质放入脱水剂中进行浸泡后，采用钴‑60对牛角膜基质进行辐照后，将所制备的牛角膜基质放干燥保存。

【技术特征摘要】
1.一种利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，包括以下步骤：
从新鲜牛眼球上切取角膜片后，并将角膜片浸泡在低渗溶液中；
由角膜片上得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，将其反复冻
融，以使细胞破碎；
依次采用缓冲液对牛角膜基质进行漂洗、以及将其放入脱细胞试剂中进
行浸泡后，采用超纯水对其进行冲洗；
将牛角膜基质放入另一种脱细胞试剂中进行浸泡后，再次采用超纯水对
牛角膜基质进行冲洗；
将牛角膜基质放入脱水剂中进行浸泡后，采用钴-60对牛角膜基质进行辐
照后，将所制备的牛角膜基质放干燥保存。
2.根据权利要求1所述的利用新鲜牛角膜以制备牛角膜基质的方法，其
特征在于，上述方法的具体步骤如下：
S1、取12小时内的新鲜牛眼球，用生理盐水冲洗干净后，用显微角膜环
钻切取200～500微米的角膜片，将其放于低渗溶液中浸泡30～60分钟；
S2、用手术刀刮掉角膜片的上皮层，保留前弹力层，撕掉后弹力层和内
皮层，得到包含前弹力层和部分基质层的牛角膜基质，将其反复冻融使细胞
破碎；
S3、依次采用缓冲液对牛角膜基质漂洗2～3次、以将其放入脱细胞试剂
浸泡15～90分钟，再采用超纯水对其进行冲洗2～3次；
S4、将牛角膜基质放入另一种脱细胞试剂浸泡15～30分钟后，再采用超
纯水对其进行冲洗2次；
S5、将牛角膜基质放入脱水剂中进行浸泡3～6小时后，采用剂量为
5～15KGy的钴-60对牛角膜基质辐照1～5小时后，...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩斌，张诚，张旭，
申请(专利权)人：北京赛尔泰和生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11