角膜缘干细胞及其培养方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种角膜缘干细胞及其培养方法和应用，其中，该角膜缘干细胞的培养方法包括步骤如下：获取可增殖角膜缘组织；将所述可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中培养；其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.01～0.09mmol/L。本发明专利技术角膜缘干细胞的培养方法可以抑制角膜缘干细胞的分化，避免角膜缘干细胞因分化而产生其他细胞，保证培养得到的角膜缘干细胞的纯度，降低分化程度，从而提高了移植角膜缘干细胞治疗相应眼部疾病的疗效。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞
，尤其涉及一种角膜缘干细胞及其培养方法和应用。
技术介绍
角膜由外而内依次包括：上皮层、前弹力层(Bowman膜)、基质层、后弹力层(Decemet膜)和内皮层。角膜上皮层具有多层细胞，包括与前弹力层连接的基底层细胞。角膜上皮层具有保护眼球，稳定泪膜，维持角膜透明性等功能，是一种不断自我更新的组织，而且，角膜上皮层的完整性的维持依赖于表浅细胞不断脱落和基底层细胞不断增殖以取代脱落细胞来实现，而上皮细胞持续不断的水平向心运动和垂直向上运动就源于角膜缘基底层干细胞的增殖和分化。角膜缘是角膜和结膜的移行区，角膜缘上皮层多于10层，干细胞存在于角膜缘上皮层的基底层，在保持角膜的生理生化和角膜的营养及完整性的维持、免疫反应中占有重要地位。角膜缘干细胞不仅可以分化、增殖为角膜上皮细胞，更重要的是干细胞像一道屏障，阻止结膜上皮细胞移行至角膜表面，这对于保持角膜的透明性与正常生理功能有着重要的意义。角膜病是我国第二位致盲眼部疾病。随着现代眼科学的发展，角膜缘干细胞缺乏或功能障碍的疾病，如眼表泪液病、无虹膜、化学和热烧伤、辐射损害、Stevens-Johnson综合征、眼瘢痕性天疱疮等，可以通过角膜缘干细胞移植进行治疗。因此，角膜缘干细胞对于上述眼部疾病的治疗起着至关重要的作用。然而，现有方法培养的角膜缘干细胞的纯度低，分化程度高，进而导致使用该角膜缘干细胞进行移植时，对上述眼部疾病的治疗效果不佳。
技术实现思路
本专利技术的主要目的在于提供一种角膜缘干细胞的培养方法，旨在提高培养的角膜缘干细胞的纯度，降低分化程度。为实现上述目的，本专利技术提供一种角膜缘干细胞的培养方法，所述角膜
缘干细胞的培养方法包括步骤如下：获取可增殖角膜缘组织；将所述可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中培养；其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.01～0.09mmol/L。优选地，所述将所述可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中的步骤之后，还包括步骤如下：向所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，使所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～100ng/ml。优选地，所述获取可增殖角膜缘组织的步骤，包括：获取角膜缘组织；将所述角膜缘组织置于无钙MEM培养基中培养，当所述角膜缘组织的上皮层的基底层细胞和与所述基底层细胞相连的上层细胞出现间隙时，除去所述上层细胞，而获得可增殖角膜缘组织。优选地，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.06mmol/L。优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10～60ng/ml。优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15ng/ml。优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子为重组牛碱性成纤维细胞生长因子。优选地，所述FBS在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的质量分数为1～14％。本专利技术还提供一种上述角膜缘干细胞的培养方法获得的角膜缘干细胞。本专利技术还提供一种上述角膜缘干细胞在制备治疗角膜病药剂中的应用。本专利技术技术方案，通过采用低钙的MEM培养基对角膜缘组织进行培养而得到角膜缘干细胞，同时可以抑制角膜缘干细胞的分化，避免角膜缘干细胞因分化而产生其他细胞，保证培养得到的角膜缘干细胞的纯度，降低分化程
度，从而提高了移植角膜缘干细胞治疗相应眼部疾病的疗效；进一步地，向MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，该碱性成纤维细胞生长因子可以促进角膜缘干细胞的增殖，增加干细胞的数量，且可以保证角膜缘干细胞的活性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的内容获得其他的附图。图1为本专利技术实施例1培养的角膜缘干细胞进行免疫细胞染色后的扫描电镜示意图，图中箭头标示了染色的细胞膜；图2为本专利技术实施例2培养的角膜缘干细胞进行免疫细胞染色后的扫描电镜示意图；图3为本专利技术实施例3培养的角膜缘干细胞进行免疫细胞染色后的扫描电镜示意图，图中箭头标示了染色的细胞膜。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供一种角膜缘干细胞的培养方法，该角膜缘干细胞的培养方法包括步骤如下：S1、获取可增殖角膜缘组织；S2、将该可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中培养；其中，Ca2+在该含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.01～0.09mmol/L。本专利技术培养方法通过采用低钙的MEM培养基对角膜缘组织进行培养而
得到角膜缘干细胞，可以抑制角膜缘干细胞的分化，避免角膜缘干细胞因分化而产生其他细胞，保证培养得到的角膜缘干细胞的纯度，降低了分化程度，从而提高了移植角膜缘干细胞治疗相应眼部疾病的疗效。进一步地，在步骤S2之后，该角膜缘干细胞的培养方法还包括步骤如下：S3、向该含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，使碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～100ng/ml。该碱性成纤维细胞生长因子可以促进角膜缘干细胞的增殖，增加干细胞的数量，且可以保证角膜缘干细胞的活性。需要说明的是，根据本领域技术人员的常识，该碱性成纤维细胞生长因子的浓度仅为向MEM培养基中刚刚加入完时混合均匀的浓度，由于角膜缘组织具有活性，因此，不能理解为培养一段时间后的浓度。进一步地，该步骤S1具体包括如下步骤：S10、获取角膜缘组织；S11、将该角膜缘组织置于无钙MEM培养基中培养，当该角膜缘组织的上皮层的基底层细胞和与基底层细胞相连的上层细胞出现间隙时，除去上层细胞，而获得可增殖角膜缘组织。该可增殖角膜缘组织的获取方法简单，只需将角膜缘组织培养一段时间，上层细胞和基底层细胞即可自行脱离。需要说明的是，本专利技术角膜缘组织的上皮层具有多层细胞，其中，角膜缘干细胞产生于角膜缘组织的上皮层的基底层细胞，而基底层细胞以上的上层细胞会随着基底层细胞的生长而脱落。进一步地，该碱性成纤维细胞生长因子的浓度为10～60ng/ml。当碱性成纤维细胞生长因子浓度保持在10～60ng/ml可以保持对干细胞较高的增殖促进作用，且保持干细胞较高的活性。进一步地，FBS(胎牛血清)在含FBS和Ca2+的MEM培养基中的质量分数为1～14％。该胎牛血清可以为角膜缘组织提供细胞生长必须的营养成份，同时起酸碱度缓冲液作用。本专利技术还提供一种上述角膜缘干细胞的培养方法获得的角膜缘干细胞。该角膜缘干细胞可以通过施行角膜缘干细胞移植，改善或重建眼表结构，有效地治疗因角膜缘干细胞缺乏或功能障碍的疾病，同时提高疗效。本专利技术还提供一种上述角膜缘干细胞在制备治疗角膜病药剂中的应用。将该角膜缘干细胞应用于制备治疗角膜病药剂中，如角膜片或干细胞制剂等等，方便角膜缘干细胞的存储和活性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，包括步骤如下：获取可增殖角膜缘组织；将所述可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中培养；其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.01～0.09mmol/L。

【技术特征摘要】
1.一种角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，包括步骤如下：获取可增殖角膜缘组织；将所述可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中培养；其中，所述Ca2+在所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中的浓度为0.01～0.09mmol/L。2.如权利要求1所述的角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，所述将所述可增殖角膜缘组织加入含FBS和Ca2+的MEM培养基中的步骤之后，还包括步骤如下：向所述含FBS和Ca2+的MEM培养基中加入碱性成纤维细胞生长因子，使所述碱性成纤维细胞生长因子的浓度为1～100ng/ml。3.如权利要求1或2所述的角膜缘干细胞的培养方法，其特征在于，所述获取可增殖角膜缘组织的步骤，包括：获取角膜缘组织；将所述角膜缘组织置于无钙MEM培养基中培养，当所述角膜缘组织的上皮层的基底层细胞和与所述基底层细胞相连的上层细胞出现间隙时，除去所述上层细胞，而获得...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾宪卓，鲁菲，
申请(专利权)人：深圳爱生再生医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44