AcSDKP在角膜缘干细胞分离培养中的应用及角膜缘干细胞的培养方法技术

本发明专利技术涉及干细胞培养领域，尤其涉及AcSDKP在角膜缘干细胞分离培养中的应用及角膜缘干细胞的培养方法。本发明专利技术提供的培养基中，以胎牛血清促进角膜缘干细胞的生长，以AcSDKP抑制成纤维细胞的生长。因此，采用本发明专利技术提供的培养基能够具有选择性的分离角膜缘干细胞，且分离培养所得的角膜缘干细胞的纯度和数量皆较高，且由于成纤维细胞的生长受到抑制，角膜缘干细胞受到成纤维细胞分泌物的影响较少，干性保持良好。实验表明，采用本发明专利技术提供的培养基分离角膜缘干细胞，细胞中抗体CX43的阳性率为0.1％，AE5的阳性率为0.3％，BrdU的阳性率为50.3％，PCNA的阳性率为45.9％。该效果显著优于现有技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞培养领域，尤其涉及AcSDKP在角膜缘干细胞分离培养中的应 用及角膜缘干细胞的培养方法。
技术介绍
角膜缘为角膜和结膜、巩膜交界部分，与角膜鉴别的标志是Bowman氏膜的终止 处；与结膜的鉴别标志是不含杯状细胞，宽约1mm，此处仅有上皮层和基质层，其上皮细胞 层超过10层，排列不规则，细胞呈小的圆柱状，核深染，其深部基底细胞为一层小圆柱状或 立方形细胞，细胞核为卵圆形，与表面平行.在基底部乳头形成，形成特殊的"栅栏"样上皮 结构，其中含有色素和丰富的血管网，并与基底膜联系紧密。 角膜缘干细胞是角膜缘细胞的一个亚群，具有独特的生物学特性：生存期长，分化 度低，细胞周期长，DNA合成期短，具有高度的分化和增殖潜能等。干细胞分裂产生两个子 细胞，一个保持母细胞表型，继续成为干细胞，另一个演化为具有细胞功能的上皮细胞。在 自身更新的组织内干细胞被认为是细胞谱系的起源，同时也是细胞增殖和分化的源泉。 目前开展的角膜缘干细胞移植，包括自体或异体角膜缘组织移植和体外培养的角 膜缘干细胞移植。自体角膜缘组织移植，当取供眼角膜缘组织超过2/3周，可导致供眼角膜 缘干细胞缺陷，继而引起眼表病变。而且，如果当自体眼已处于亚临床状态时，取材后供眼 眼表病变则会加重，进而引起视力下降。此外，自体角膜缘组织移植不适合双眼角膜缘病变 的患者。异体角膜缘组织移植存在排斥反应。因此，采用体外培养的角膜缘干细胞移植联 合穿透性角膜移植治疗严重的角膜病变，近年来成为人们关注的热点。 对于角膜缘干细胞的原代获取，目前已有的分离方法主要有两种：（1)酶消化法。 用胰蛋白酶对用含双抗PBS漂洗干净并获取角膜缘组织进行消化，直至细胞分离出来，过 筛，离心并接种培养。（2)组织块贴壁法。分别用含双抗的PBS漂洗干净人角膜缘组织，目艮 科剪把角膜缘组织剪碎成2X2_3组织块，用培养基接种于培养皿中进行培养。上述两种 方法的分离出来的细胞中会带有少量成纤维细胞。成纤维细胞在后期培养的过程中会影响 角膜缘干细胞的增殖，且其分泌的产物会促进低分度低的角膜缘干细胞增殖、分化成带有 细胞功能的角膜缘上皮细胞，使得角膜缘干细胞纯度降低。 因此，应进一步开发纯度大的角膜缘干细胞的分离培养方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供AcSDKP在角膜缘干细胞分离培养 中的应用及角膜缘干细胞的培养方法，本专利技术提供的方法所得细胞纯度良好。 本专利技术提供了AcSDKP在制备角膜缘干细胞分离培养基中的应用。 N-乙酰基-丝氨酰-天门冬酰-赖氨酰-脯氨酸（N-acetyl-Seryl-aspartyl-1 ysyl-proline，AcSDKP)是一种具有生理调控活性的四肽因子。早期研究发现，AcSDKP能 够抑制造血干细胞的增殖。近年来研究发现，AcSDKP具有类似血、管紧张素转换酶抑制剂 (ACEI)的作用。在大鼠模型中，AcSDKP能够减轻高血压和心肌梗死后心脏的纤维化。 本专利技术将其用于角膜缘干细胞的分离和培养，通过抑制角膜缘组织酶解后所得细 胞中成纤维细胞的生长，提高所得角膜缘干细胞的纯度，改善所得角膜缘干细胞的品质。 本专利技术还提供了角膜缘干细胞分离培养基，包括AcSDKP、胎牛血清和基础培养液。 在本专利技术的实施例中，本专利技术提供的角膜缘干细胞分离培养基中AcSDKP的质量 分数为〇.〇1 %~10%。 在一些实施例中，本专利技术提供的角膜缘干细胞分离培养基中AcSDKP的质量分数 为 0· 5%~1%〇 在一些实施例中，本专利技术提供的角膜缘干细胞分离培养基中AcSDKP的质量分数 为 0· 5%〇 在本专利技术的实施例中，胎牛血清与基础培养液的体积比为（10~20):(80~90)。 在一些实施例中，胎牛血清与基础培养液的体积比为10:90。 在本专利技术的实施例中，基础培养液为DMEM液体培养基。 本专利技术提供的培养基中，以胎牛血清促进角膜缘干细胞的生长，以AcSDKP抑制成 纤维细胞的生长。因此，采用本专利技术提供的培养基能够具有选择性的分离角膜缘干细胞，且 分离培养所得的角膜缘干细胞的纯度和数量皆较高，且由于成纤维细胞的生长受到抑制， 角膜缘干细胞受到成纤维细胞分泌物的影响较少，干性保持良好。 本专利技术还提供了一种角膜缘干细胞的分离培养方法，包括以下步骤： 步骤1 :将胎儿角膜缘组织以胰蛋白酶解； 步骤2 :将酶解后的产物以本专利技术提供的角膜缘干细胞分离培养基培养后，传代。 在本专利技术的实施例中，胎儿角膜缘干细胞取自死亡的胎儿。 在本专利技术的实施例中，胎儿为兔、大鼠或人类胎儿。 在一些实施例中，胎儿为人类胎儿。 在一些实施例中，人类胎儿的胎龄为3个月~7个月。 在本专利技术的实施例中，胰蛋白酶以PBS溶液配制，pH值为7. 2-7. 4。 在本专利技术的实施例中，胰蛋白酶溶液中胰蛋白酶的质量分数为0. 25%。 在本专利技术的实施例中，胰蛋白酶溶液与胎儿角膜缘组织的体积比为1:5。 在本专利技术的实施例中，胰蛋白酶酶解的温度为37°C，时间为lOmin~20min。 在一些实施例中，胰蛋白酶酶解的时间为15min。 在本专利技术的实施例中，步骤2所述培养的接种密度为1X105个/ml。 在本专利技术的实施例中，酶解的终止液为含有FBS的PBS。 在一些实施例中，酶解的终止液中FBS的体积分数为10%。 在一些实施例中，步骤2中所述培养的条件为5%C02、37°C、湿度95%。 在一些实施例中，步骤2中所述培养的时间为24h。 在一些实施例中，步骤2中所述培养至细胞汇合度为80 %。 在本专利技术的实施例中，传代具体为：以胰蛋白酶消化细胞后，以本专利技术提供的角膜 缘干细胞分离培养基培养。 本专利技术提供了AcSDKP在角膜缘干细胞分离培养中的应用及角膜缘干细胞的培养 方法，本专利技术提供的培养基中，以胎牛血清促进角膜缘干细胞的生长，以AcSDKP抑制成纤 维细胞的生长。因此，采用本专利技术提供的培养基能够具有选择性的分离角膜缘干细胞，且分 离培养所得的角膜缘干细胞的纯度和数量皆较高，且由于成纤维细胞的生长受到抑制，角 膜缘干细胞受到成纤维细胞分泌物的影响较少，干性保持良好。实验表明，采用本专利技术提供 的培养基分离角膜缘干细胞，细胞中抗体CX43的阳性率为0. 1%，AE5的阳性率为0. 3%， BrdU的阳性率为50. 3%，PCNA的阳性率为17. 8%。该效果显著优于现有技术。【具体实施方式】 本专利技术提供了AcSDKP在角膜缘干细胞分离培养中的应用及角膜缘干细胞的培养 方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所 有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本专利技术。 本专利技术的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本专利技术内 容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本专利技术 技术。 本专利技术采用的试剂或仪器皆为普通市售品，皆可于市场购得。 下面结合实施例，进一步阐述本专利技术： 实施例1 培养基：90%DMEM培养基+10%FBS，其中AcSDKP的质量分数为0. 5%。 将胎龄为3~7个月死亡胎儿的眼球于无菌环境中用含双抗（青霉素-链霉素， 1X)的PBS浸泡3本文档来自技高网...

【技术保护点】
AcSDKP在制备角膜缘干细胞分离培养基中的应用。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：葛啸虎，陈海佳，王一飞，吴子杰，张维敏，
申请(专利权)人：广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44