分离的肝脏干细胞制造技术

本发明专利技术涉及分离的肝脏祖细胞干细胞，及其细胞群，其中所述祖细胞干细胞来源于成体肝脏尤其是人类的肝脏。本发明专利技术还涉及所述祖细胞干细胞在医学、肝病学、肝脏代谢出生缺陷、移植、传染性疾病、肝脏衰竭中的用途。本发明专利技术还涉及分离这些细胞的方法、其培养物、分化前后表征、及其在移植、人类疾病的动物模型、毒理学和药理学中的用途。

【技术实现步骤摘要】
分离的肝脏干细胞本申请是中国专利申请200680048822.0的分案，后者是2006年12月14日提交的PCT申请PCT/EP2006/012046于2008年6月23日进入中国国家阶段的申请。
本专利技术涉及来自成体肝脏的分离的肝脏祖细胞或干细胞，及其在医学、肝病学、肝脏代谢出生缺陷、移植、传染性疾病、肝脏衰竭中的用途。本专利技术还涉及分离这些细胞的方法、其培养物、分化前后表征、及其在移植、人类疾病的动物模型、人造器官装置、毒理学和药理学中的用途。
技术介绍
肝脏是重要器官，其发挥很多重要的功能，如葡萄糖的体内平衡、异型生物质的(xenobiotic)脱毒或大分子合成。因此，多种肝脏功能之一受损能够对健康产生显著影响。根据世界卫生组织(WHO)，全球急或慢性肝病的发病率使这些疾病成为第五至第九位的致死原因。目前为止，对晚期肝脏疾病的根治方法只有肝脏移植术。经历外科肝脏移植的患者的结局很好，95%以上得以康复。然而，即使有包括肝脏分割和活体肝移植供体在内的新型外科技术，器官的日益紧缺使得等待治疗名单中的死亡率不断攀升。因此，在移植医学研究中的重要目标就是证明肝脏细胞(liver cell)在肝脏再生和肝病治疗中的潜在用途。肝脏细胞移植(liver cell transplantation, LCT)是一种新兴方法,涉及在受体肝门系统中输注肝脏细胞悬液。作为移植结果其目的在于恢复受体肝脏功能以及重建(repopulation)患病的肝实质(liver parenchyma) ICT首先被证实在动物模型中有效,其中已经表明同源肝细胞(hepat ocyte)能够长期存活并纠正各种酶缺陷(综述参见Najimi和 Sokal.2005.Minerva Pediatr57 (5):243-57)。人类当中，早期研究专门用于治疗急性肝脏衰竭。这些研究促使临床工作者将LCT扩展用于其他适应症，目前为止，全球已经报道有各种缺陷的至少30个案例(Strom等人1997.Transplant Proc29 (4):2103-6)。在代谢疾病的具体领域中，十三个案例中报告了肝脏细胞用于治疗I型Crigler-Najjar综合征、尿素循环缺陷或罕见疾病如婴儿Refsum病的用途。这些研究证明了肝细胞在肝实质中的植入以及随后在移植后长达18月患者状况的改善。然而，由于用于移植的成熟人类肝脏细胞仍然有限，实际上或多或少和全肝可用性一样受限，研究还意图从其他来源获得可移植的细胞，如来自胚胎或成体来源的祖细胞和干细胞，这些细胞例如可在体外扩增，并且能够尤其是在移植后体内分化成有功能的成熟肝细胞。因此，迫切需要开发出新的在治疗肝脏相关疾病相关的各种疾病或病况中有用的方法，尤其是考虑到目前大多数这些疾病的可用治疗不足时。历史上，由于观察到胚胎干(ES)细胞无限克隆分裂以及多能分化成整个组织的子细胞(daughter cell)的能力，其曾被认为仅参与器官发生。另一方面，成体器官中的再生过程典型情况下归因于成体祖细胞。然而，考虑到在成体器官中发现了表达胚胎标志物的干细胞，该理论已被修正。因此，现在描述干细胞和祖细胞特征时不仅基于发育过程(胚胎对成体)还基于特异性细胞标志物的存在。实际上，细胞标志物如膜蛋白或转录因子的表达可随着分化途径有很大变化，它们反映了各种刺激(如环境刺激)和细胞需求。通常在分化过程中，观察到干细胞将逐渐停止展示指示其多能性的标志物如Oct-4，而表达有助于后续阶段的标志物如特定谱系的标志物。作为一个非限定性的实例，Oct-4随着成熟而逐渐丢失，另一方面进入内胚层谱系的细胞开始表达甲胎蛋白。就通过细胞移植来进行肝脏再生而言，可以考虑多种可能的来源细胞类型。例如由于ES细胞的多能性，预期其能够再生任何器官。实际上，本领域中这条路已经得到广泛探索。然而，当ES细胞引入子宫(in utero)以外的任何其他组织中时ES细胞倾向于引起肿瘤生长。因此，其体内应用由于致癌风险仍然受到限制。即便之前ES细胞在体外分化成功，用于人类接种都不够安全。更加安全的替代方式是使用成体祖细胞，不像ES细胞，其倾向于表现出受限的克隆分裂能力以及分化产生更加有限命运的子细胞。肝脏中，已经描述过成体祖细胞如卵圆细胞(胆管细胞和肝细胞前体)或小肝细胞样细胞。然而，其在正常成体器官中的稀少使得其医学用途变得困难。因此，具有降低或没有偏离向致癌风险并显示出克隆分裂能力的成体干细胞将代表着细胞移植来源的重大进步。多种类型的成体干细胞目前在肝脏细胞移植研究中得以评价。例如，由于具有从另一个谱系转分化成更成熟细胞的能力，正在对来自外周或脐带血的间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSC)进行研究。并且，也在肝脏再生潜能方面对来自骨髓的造血干细胞进行研究。 成体干细胞的体外表征仍然困难，本领域目前可以接受的是这种表征可以优先包括检测(i)胚胎起源或谱系(尤其是中胚层、内胚层、外胚层或造血干细胞)的标志物，[11]反映分化水平的标志物的表达，因而在一定程度上预示了可能的不同后代，(iii)分化之后的体外或体内命运。因此，表征和区分从正常肝脏获得的成体干细胞可以方便地包括评价是否存在以下标志物:(i)反映该器官复杂胚胎起源的标志物，(?)分化标志物(如存在白蛋白)以及(iii)至少一个指示干细胞命运的标志物。根据目前的知识，肝脏主要源自内胚层，肝细胞是内胚层谱系(lineage)的一部分。然而，肝细胞的形成还涉及内胚层上皮和心原性中胚层之间的相互作用。此外，在胎儿发育中，造血细胞生成发生在肝脏中。考虑到发育中的这种相互影响，在提及成体肝脏干细胞中存在的标志物时需要有开放性思维，因为内胚层、中胚层和/或造血系的标志物都可预期。当评估分化水平和细胞类型归属时，可以评价不同细胞标志物，正如本公开中随后进行的。例如，在细胞分化过程中有些标志物减少或消失，另一些标志物可以增加或出现，还有一些可以一直维持到特化和功能性细胞。根据非限制性实例，器官发生期间，即胎儿期间，认为肝母细胞(hepatoblast)是形成实质(尤其是肝细胞和胆细胞)的共同祖细胞，其表达细胞角蛋白-7(cytokeratin-7 ;CK-7)以及CK-19、白蛋白和甲胎蛋白。成体肝脏中，肝细胞和胆细胞的已知共同祖细胞是卵圆细胞(oval cell)，其表达CK-19、白蛋白和甲胎蛋白。分化成胆细胞后，CK-19和白蛋白继续表达，而CK-7的表达则趋于停止(认为是更不成熟细胞的一个特征)。另一方面，肝细胞维持甲胎蛋白和白蛋白的表达，但是不表达上述CK。仍然是这个实例，由此可见干细胞的表征是复杂的，但是可以优先使用标志物评价来指示细胞类型或特性。根据本专利技术人的了解，以前的研究描述了从正常成体肝脏中分离祖细胞，所述细胞展现了不止一种细胞命运。尚没有描述过能够在体外增殖并在体内分化成肝细胞(并且优选仅具有肝细胞命运)的成体肝脏干细胞。此外，以前的研究使用复杂的技术，如FACS、含钙介质或特定密度梯度来分离肝脏干细胞。因此，本专利技术的一个目标就是提供具有改进特性的新的成体肝脏来源的祖细胞或干细胞，并且尤其可用于例如肝脏细胞移植。本专利技术还提供分离所述细胞的简单方法。
技术实现思路
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【技术保护点】
分离的人肝脏祖细胞或干细胞、或者其细胞系或包含所述细胞的细胞群在制备用于肝脏祖细胞或干细胞移植从而治疗肝脏疾病的药物中的用途，其中：a)所述分离的肝脏祖细胞或干细胞来源于人成年肝脏，表达标志物CD90、CD73、CD44、波形蛋白、α‑平滑肌肌动蛋白、白蛋白并且对CK‑19呈阴性；和b)所述肝脏疾病是基于肝脏的先天性代谢缺陷或者特征在于肝脏质量和/或功能损失的缺陷。

【技术特征摘要】
2005.12.21 EP 05447286.5;2006.10.17 EP PCT/EP2006/1.分离的人肝脏祖细胞或干细胞、或者其细胞系或包含所述细胞的细胞群在制备用于肝脏祖细胞或干细胞移植从而治疗肝脏疾病的药物中的用途，其中: a)所述分离的肝脏祖细胞或干细胞来源于人成年肝脏，表达标志物CD90、CD73、CD44、波形蛋白、α -平滑肌肌动蛋白、白蛋白并且对CK-19呈阴性；和 b)所述肝脏疾病是基于肝脏的先天性代谢缺陷或者特征在于肝脏质量和/或功能损失的缺陷。2.根据权利要求1的用途，其中所述分离的肝脏祖细胞或干细胞还表达选自下列的一种或更多种其他肝脏或肝细胞标志物:CD29、甲胎蛋白(AFP)、α-l抗胰蛋白酶、HNF-4和MRP2转运蛋白。3.分离的人肝脏祖细胞或干细胞、或者其细胞系或包含所述细胞的细胞群在制备用于肝脏祖细胞或干细胞移植从而治疗肝脏疾病的药物中的用途，其中: a)所述分离的人肝脏祖细胞或干细胞是CD90、CD29和CD44阳性，并且其为白蛋白阳性、波形蛋白阳性、和α -平滑肌肌动蛋白阳性，并且对⑶45、⑶34、⑶117和CK-19呈阴性；和 b)所述肝脏疾病是基于肝脏的先天性代谢缺陷或者特征在于肝脏质量和/或功能损失的缺陷。4.根据...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾蒂安·索卡尔，穆斯塔法·纳吉米，
申请(专利权)人：鲁汶大学，
类型：发明
国别省市：比利时;BE