一种人真皮干细胞的分离方法技术

本发明专利技术公开了一种人真皮干细胞的分离方法。该方法包括如下步骤(1)将离体的人的皮肤组织用Dispase Ⅱ进行处理；(2)将真皮部分和表皮部分撕开，并用Ⅰ型胶原酶工作液进行消化处理；(3)用Ⅰ型胶原酶工作液反复吹消化处理后的组织液，过滤；(4)将滤液进行离心，分别取沉淀和上清液；(5)将经步骤(4)所得的沉淀进行重悬，得到组织液1；(6)将经步骤(4)所得的上清液进行离心，弃上清，取沉淀，对所述沉淀进行重悬，得到组织液2；(7)将组织液1和组织液2混合，得到的组织液3；(8)对组织液3中的细胞进行筛选，得到所述人真皮干细胞。本发明专利技术利用酶处理液代替常规酶液，有效的提高了真皮干细胞的分离效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种人真皮干细胞的分离方法。
技术介绍
近年来的研究中发现真皮组织中存在着一种具有自我更新和多向分化能力的成体干细胞，被称为真皮干细胞，又叫真皮多能干细胞、皮肤前提细胞、皮肤间充质干细胞。真皮层主要有结缔组织、胶原纤维以及弹性纤维构成，是可能与肌肤老化最有直接关系的部位。因此，获得真皮干细胞，对于组织学模型的建立以及皮肤机能的体外研究都有着重要的意义。常规的真皮干细胞分离方法是酶解法。将皮肤组织的脂肪层剥离后，直接利用0.25％胰蛋白酶进行细胞消化皮肤组织，再利用筛网过滤、离心、沉淀、悬浮克隆培养等方法获得较为纯净的真皮干细胞。但是多次机械性的分离过程容易对细胞造成伤害，真皮干细胞的得率偏低。因此，为了尽可能有效的分离真皮干细胞，开发一种对细胞作用温和的、更加便于分离真皮干细胞的方法是有必要的。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种人真皮干细胞的分离方法。本专利技术所提供的人真皮干细胞的分离方法包括如下步骤：(1)将离体的人的皮肤组织进行消毒、去除脂肪组织；(2)将经步骤(1)处理后的皮肤组织用Dispase Ⅱ进行处理；(3)将经步骤(2)处理后的组织的真皮部分和表皮部分撕开，并将真皮部分剪碎，用Ⅰ型胶原酶工作液进行消化处理；(4)用Ⅰ型胶原酶工作液反复吹经步骤(3)消化处理后所得的组织液，使细胞分散；(5)将经步骤(4)处理后的体系进行过滤，取滤液；(6)将经步骤(5)过滤所得的滤液进行离心，分别取沉淀和上清液；(7)将经步骤(6)所得的沉淀进行重悬，得到组织液1；(8)将经步骤(6)所得的上清液进行离心，弃上清，取沉淀，对所述沉淀进行重悬，得到组织液2；(9)将组织液1和组织液2混合，得到的组织液3；(10)用流式细胞仪对步骤(9)所得的组织液3中的细胞进行筛选，得到所述人真皮干细胞。上述方法中，所述人的皮肤组织进行消毒包括如下步骤：将人的皮肤组织放入碘酊中浸泡3min，在放入75％的酒精中浸泡洗涤3min，最后用DPBS浸泡漂洗3次，每次漂洗3min。上述方法中，所述在用Dispase Ⅱ进行消化处理前还包括将所述经步骤(1)处理后的皮肤组织剪成5mm×5mm小块的步骤。上述方法中，所述用Dispase Ⅱ进行处理的温度是4℃；所述处理的时间是过夜。上述方法中，所述用Ⅰ型胶原酶工作液进行消化处理的温度为37℃；所述消化处理的时间为1h；所述消化处理的过程中3min摇1次。上述方法中，所述Ⅰ型胶原酶工作液的配制方法是：向20ml的DMEM/F12培养基中加入0.5％的Ⅰ型胶原酶。上述方法中，所述用Ⅰ型胶原酶工作液反复吹消化处理后的组织液前还需将Ⅰ型胶原酶工作液进行稀释的步骤。上述方法中，所述重悬使用培养基1。上述方法中，所述培养基1是含有体积分数为10％的胎牛血清的DMEM培养基。上述方法中，所述过滤的方法为用100μm和40μm的滤膜依次进行过滤。上述方法中，所述离心的温度为4℃；所述离心的速度为360g；所述离心时间为8min。上述方法中，所述筛选是选择同时具有β1整合素和CD49f细胞表面标志物的细胞。本专利技术的另一个目的是提供上述所述的方法在分离人真皮干细胞中的应用。本专利技术提供了一种人真皮干细胞的分离方法。本专利技术利用酶处理液代替常规酶液，二次离心法获得的真皮干细胞标记物为阳性的细胞高于常规方法，有效的提高了真皮干细胞的分离效果。附图说明图1为双酶法β1整合素标记的流式检测结果。图2为双酶法CD49标记的流式检测结果。图3为双酶法β1整合素和CD49双标记的流式检测结果。图4为常规方法β1整合素标记的流式检测结果。图5为常规方法CD49标记的流式检测结果。图6为常规方法β1整合素与CD49双标记流式检测结果。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实验材料：手术废弃的人的包皮组织，将其放在保存液中保存，待用。Dispase Ⅱ工作液配制：向20mL DPBS中加入0.1％的BSA与0.25％的分散酶(Dispase Ⅱ)；Dispase Ⅱ可购买于Roche，产品目录号为4942078001。Ⅰ型胶原酶工作液的配制方法：向20ml的DMEM/F12培养基中加入0.5％的Ⅰ型胶原酶。实施例1、人真皮干细胞的分离方法1、消毒：先将包皮组织放入碘酊中充分浸泡3min，在放入75％的酒精中充分浸泡洗涤3min，最后用DPBS(invitrogen，14040-133)浸泡漂洗3次，3min/次。2、将步骤1中消毒后的包皮组织上的脂肪组织剪下，丢弃；并将皮肤部分剪成5mm×5mm小块，放入装有Dispase Ⅱ工作液的离心管中，4℃处理过夜。3、将皮肤组织取出，放入DPBS中，用镊子将真皮和表皮部分撕开，将真皮部分剪碎，放入Ⅰ型胶原酶工作液中，37℃条件下处理1h，每3min摇1次。4、用HBSS(invitrogen，14025092)稀释Ⅰ型胶原酶工作液，并用稀释后的酶解液反复吹(吹吸70次)步骤3中的组织液，将细胞分散。5、将4中组织液依次通过100μm和40μm的滤膜过滤。6、将5中的滤液在4℃条件下，360g离心8min，分别收集上清液和沉淀组织。7、将6中离心得到的沉淀组织利用DMEM培养基(含有10％的胎牛血清(FBS))稀释至细胞浓度为1.7×106个/mL。8、将6中的上清液离心，在4℃条件下，360g离心8min，弃上清，收集沉淀，用DMEM培养基(含有10％的胎牛血清(FBS)将沉淀组织稀释至细胞浓度为1.7×106个/mL。9、将步骤7和步骤8两次离心得到的组织液混合，用DMEM培养基(含有10％的胎牛血清(FBS))将混合液稀释至浓度为2.5×105个/mL，接种在培养瓶中。10、利用流式细胞仪对培养瓶中的细胞表面标志物(β1整合素、CD49f、β1整合素与CD49f-PE双标记，)进行细胞阳性率的检测，筛选出双阳性细胞，即人的真皮皮干细胞，并将其培养在DMEM培养基(含有50ng/mL的上皮生长因子(EGF)和1μg/mL的牛垂体提取物(BPE))中。实施例2、常规方法分离真皮干细胞将包皮组织从组织保存液中取出(生理盐水)，浸泡于75％酒精中洗涤，再用DPBS漂洗；将组织上的脂肪组织剪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人真皮干细胞的分离方法，包括如下步骤：(1)将离体的人的皮肤组织进行消毒、去除脂肪组织；(2)将经步骤(1)处理后的皮肤组织用Dispase Ⅱ进行处理；(3)将经步骤(2)处理后的组织的真皮部分和表皮部分撕开，并将真皮部分剪碎，用Ⅰ型胶原酶工作液进行消化处理；(4)用Ⅰ型胶原酶工作液反复吹经步骤(3)消化处理后所得的组织液，使细胞分散；(5)将经步骤(4)处理后的体系进行过滤，取滤液；(6)将经步骤(5)过滤所得的滤液进行离心，分别取沉淀和上清液；(7)将经步骤(6)所得的沉淀进行重悬，得到组织液1；(8)将经步骤(6)所得的上清液进行离心，弃上清，收集沉淀，对所述沉淀进行重悬，得到组织液2；(9)将组织液1和组织液2混合，得到的组织液3；(10)用流式细胞仪对步骤(9)所得的组织液3中的细胞进行筛选，得到所述人真皮干细胞。

【技术特征摘要】
1.一种人真皮干细胞的分离方法，包括如下步骤：
(1)将离体的人的皮肤组织进行消毒、去除脂肪组织；
(2)将经步骤(1)处理后的皮肤组织用Dispase Ⅱ进行处理；
(3)将经步骤(2)处理后的组织的真皮部分和表皮部分撕开，并将真皮部分剪
碎，用Ⅰ型胶原酶工作液进行消化处理；
(4)用Ⅰ型胶原酶工作液反复吹经步骤(3)消化处理后所得的组织液，使细胞
分散；
(5)将经步骤(4)处理后的体系进行过滤，取滤液；
(6)将经步骤(5)过滤所得的滤液进行离心，分别取沉淀和上清液；
(7)将经步骤(6)所得的沉淀进行重悬，得到组织液1；
(8)将经步骤(6)所得的上清液进行离心，弃上清，收集沉淀，对所述沉淀进
行重悬，得到组织液2；
(9)将组织液1和组织液2混合，得到的组织液3；
(10)用流式细胞仪对步骤(9)所得的组织液3中的细胞进行筛选，得到所述人
真皮干细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述人的皮肤组织进行消毒包括如
下步骤：将人的皮肤组织放入碘酊中浸泡3min，在放入75％的酒精中浸泡洗涤3min，
最后用DPBS浸泡漂洗3次，每次漂洗3min。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述在用Di...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏宁，杨丽，刘娟，赵丹，霍彤，徐歌，郑洪艳，王昌涛，
申请(专利权)人：中国检验检疫科学研究院，北京工商大学，
类型：发明
国别省市：北京;11