一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法技术

本发明专利技术涉及一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术经过人胎盘绒毛膜组织的采集、绒毛膜组织剥离，消毒、洗涤、剪碎、原代分离获得间充质干细胞及间充质干细胞的体外培养和冻存，并对分离获得的细胞进行相关检测。本发明专利技术能够从人胎盘绒毛膜组织中分离获得大量表型均一稳定的间充质干细胞，经检测符合临床应用标准。通过培养体外扩增获得满足冻存或临床使用的细胞数量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种可应用于临床级的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法。
技术介绍
间充质干细胞(MSC)是一类具有自我更新能力且在适合微环境下具有多系分化潜能的原始细胞。它首先在骨髓中发现，随后分别在脂肪、骨骼、肌肉、肺、肝、胰腺以及在脐带、脐带血、胎盘组织中分离出来。由于其具有强大的增殖能力，较强的分化能力，低免疫原性和免疫调节功能，其在临床上的应用价值越来越受人们关注。作为要应用于临床细胞治疗的细胞产品，应当具有组织取材方便，来源广泛，不受伦理限制，分离过程简单等特点。而骨髓来源的MSC取材难，细胞增殖和分化能力受供体年龄限制，异体移植存在免疫排斥强等缺点，所以寻求一种来源丰富，干细胞含量高，取材方便，无创性并且不受伦理学限制的MSCs来源已然成为如今的研究热点。最近有研究发现，人绒毛膜间充质干细胞具有自我更新和多向分化潜能，有低免疫原性，用于同种异体、异种异体移植后，不会发生免疫排斥反应，无致瘤性，这为各种疾病的细胞替代治疗提供了新的选择。绒毛膜来源于孕妇产后的胎盘组织，具有一定的弹性，易于从胎盘组织中剥离，因此绒毛膜被公认为是间充质干细胞来源之一。现有技术中，制备绒毛膜间充质干细胞的方法存在的不足之处：目前，绒毛膜间充质干细胞的分离方法有组织块培养法和酶消化法两种，应用较多的分离方法是酶消化法，酶消化法具有分离培养周期短等优点，但酶消化法所利用的酶种类繁多，多数利用胰酶和胶原酶分步处理的消化方法，耗时长，步骤繁琐，消化过程中还会对细胞造成较大伤害，使细胞活力减弱，而且分离过程中使用了多种酶和血清，引入了多种外源物质，对间充质干细胞应用于临床造成阻碍。组织块培养法获得的间充质干细胞具有细胞纯度高，细胞活力强等优点，但分离成功率低，培养周期长，而且培养中加入胎牛血清等动物源性成分，增加了培养成本，也引入了外源动物蛋白，使培养的细胞不利于临床应用。在绒毛膜剥离过程中不会去除附着在绒毛膜上的毛细血管，使得分离获得的细胞种类复杂，参杂了许多内皮细胞和血细胞，影响间充质干细胞的正常生长过程。胎盘采集及绒毛膜分离的现有技术还缺少有效减少污染的措施，防污染措施作用有限，原代培养污染率高，缺少从源头开始减少污染的方法，目前在培养环节添加抗生素只能在培养过程中抑制污染菌繁殖，不能有效减少污染；培养体系中一直添加抗生素，不利于绒毛膜干细胞的临床应用。因此如何克服现有技术的不足是目前生物医药
亟需解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种细胞均一、稳定、细胞活性好、培养周期短、可应用于临床的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，包括以下步骤：步骤（1），人胎盘组织的采集：人胎盘组织娩出后，用生理盐水对胎盘组织进行清洗以除去胎盘组织周围的血液和胎粪防止污染，然后将胎盘组织浸在胎盘保护液中，暂存于2-8℃环境中，使胎盘组织处于一个低渗、低温的缓冲环境中，保持组织中间充质干细胞的活性；所述的胎盘保护液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基；步骤（2），绒毛膜组织的剥离：在无菌环境下，将步骤（1）得到的浸在胎盘保护液中的胎盘组织的靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，然后剥离羊膜并暴露出羊膜下层的绒毛膜层，接着剪取脐带周围的绒毛膜层，并将剪取得到的绒毛膜组织置于0.9%氯化钠注射液中；步骤（3），绒毛膜组织的洗涤与消毒：先用0.9%氯化钠注射液漂洗步骤（2）得到的绒毛膜组织以去除血液，并用镊子剥去毛细血管，接着依次用含有100U/ml青霉素、100U/ml链霉素的0.9%氯化钠注射液和甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为5-10分钟，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜以去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液，达到即有效防止污染又清除抗生素的残留；步骤（4），绒毛膜组织的剪碎：将经步骤（3）清洗得到的绒毛膜组织放入无菌容器内，并加入间充质干细胞无血清培养基，使间充质干细胞处于温和的环境中，按照每10g绒毛膜组织加入1-2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成1mm3大小的组织块；步骤（5），人绒毛膜间充质干细胞原代培养：将步骤（4）得到的绒毛膜组织块均匀的平铺于细胞培养瓶中，然后置于细胞培养箱内静置30-60min，使组织块牢固的贴于培养瓶底部，之后向细胞培养瓶中添加间充质干细胞无血清培养基，使培养基刚好没过绒毛膜组织块，接着于5%CO2、37℃的细胞培养箱中静止培养，6-8天后，可见组织块周围有细胞长出，即人绒毛膜间充质干细胞；步骤（6），人绒毛膜间充质干细胞传代培养：待长出细胞汇合率达50-60%时对人绒毛膜间充质干细胞进行传代培养，弃培养基，加入重组细胞胰酶溶液消化细胞，待细胞消化完全后，加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基（即本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积与的间充质干细胞无血清培养基的体积比是1：5），以终止重组细胞胰酶作用，然后离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，并移至新的培养瓶中置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养；培养过程中注意观察细胞生长状态，培养基营养不够或PH值不符时应及时进行补充或更换新的上述无血清培养基；步骤（7），人绒毛膜间充质干细胞的冻存：当步骤（6）培养的细胞汇合率达90%后进行细胞冻存，先用重组细胞胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，再加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基终止重组细胞胰酶溶液作用（即本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积与的间充质干细胞无血清培养基的体积比是1：5），离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，重悬混匀后，将重悬溶液置于冻存管中；步骤（8），冻存细胞缓慢降温：将步骤（7）得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，-80℃冰箱过夜放置，第二天转入-196℃液氮罐中长期储存；步骤（9），冻存细胞的复苏：从步骤（8）的液氮罐中取出冻存管后，置于37℃水浴锅中迅速融化，1200-1800rpm离心5min，去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%CO2、37℃细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤（1），人胎盘组织的采集：人胎盘组织娩出后，用生理盐水对胎盘组织进行清洗以除去胎盘组织周围的血液和胎粪，然后将胎盘组织浸在胎盘保护液中，暂存于2‑8℃环境中；所述的胎盘保护液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基；步骤（2），绒毛膜组织的剥离：在无菌环境下，将步骤（1）得到的浸在胎盘保护液中的胎盘组织的靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，然后剥离羊膜并暴露出羊膜下层的绒毛膜层，接着剪取脐带周围的绒毛膜层，并将剪取得到的绒毛膜组织置于0.9%氯化钠注射液中；步骤（3），绒毛膜组织的洗涤与消毒：先用0.9%氯化钠注射液漂洗步骤（2）得到的绒毛膜组织以去除血液，并用镊子剥去毛细血管，再用含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的0.9%氯化钠注射液浸泡绒毛膜组织，接着用甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为5‑10分钟，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜以去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液；步骤（4），绒毛膜组织的剪碎：将经步骤（3）清洗得到的绒毛膜组织放入无菌容器内，并加入间充质干细胞无血清培养基，按照每10g绒毛膜组织加入1‑2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成1mm3大小的组织块；步骤（5），人绒毛膜间充质干细胞原代培养：将步骤（4）得到的绒毛膜组织块均匀的平铺于细胞培养瓶中，然后置于细胞培养箱内静置30‑60min，之后向细胞培养瓶中添加间充质干细胞无血清培养基，使培养基刚好没过绒毛膜组织块，接着于5%CO2、37℃的细胞培养箱中静止培养，6‑8天后，可见组织块周围有细胞长出，即人绒毛膜间充质干细胞；步骤（6），人绒毛膜间充质干细胞传代培养：待长出细胞汇合率达50‑60%时对人绒毛膜间充质干细胞进行传代培养，弃培养基，加入重组细胞胰酶溶液消化细胞，待细胞消化完全后，加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基，以终止重组细胞胰酶作用，然后离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，并移至新的培养瓶中置于5%CO2、37℃的细胞培养箱中培养；步骤（7），人绒毛膜间充质干细胞的冻存：当步骤（6）培养的细胞汇合率达90%后进行细胞冻存，先用重组细胞胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，再加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基终止重组细胞胰酶溶液作用，离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，重悬混匀后，将重悬溶液置于冻存管中；步骤（8），冻存细胞缓慢降温：将步骤（7）得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，‑80℃冰箱过夜放置，第二天转入‑196℃液氮罐中长期储存；步骤（9），冻存细胞的复苏：从步骤（8）的液氮罐中取出冻存管后，置于37℃水浴锅中迅速融化，1200‑1800rpm离心5min，去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%CO2、37℃细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，于5%CO2、37℃细胞培养箱继续培养。...

【技术特征摘要】
1.一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤（1），人胎盘组织的采集：人胎盘组织娩出后，用生理盐水对胎盘组织进行清洗以
除去胎盘组织周围的血液和胎粪，然后将胎盘组织浸在胎盘保护液中，暂存于2-8℃环境
中；
所述的胎盘保护液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基；
步骤（2），绒毛膜组织的剥离：在无菌环境下，将步骤（1）得到的浸在胎盘保护液中的胎
盘组织的靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，然后剥离羊膜并暴露出羊膜下层的绒毛膜层，接着
剪取脐带周围的绒毛膜层，并将剪取得到的绒毛膜组织置于0.9%氯化钠注射液中；
步骤（3），绒毛膜组织的洗涤与消毒：先用0.9%氯化钠注射液漂洗步骤（2）得到的绒毛
膜组织以去除血液，并用镊子剥去毛细血管，再用含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的
0.9%氯化钠注射液浸泡绒毛膜组织，接着用甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为
5-10分钟，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜以去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑
注射液；
步骤（4），绒毛膜组织的剪碎：将经步骤（3）清洗得到的绒毛膜组织放入无菌容器内，并
加入间充质干细胞无血清培养基，按照每10g绒毛膜组织加入1-2ml间充质干细胞无血清培
养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成1mm3大小的组织块；
步骤（5），人绒毛膜间充质干细胞原代培养：将步骤（4）得到的绒毛膜组织块均匀的平
铺于细胞培养瓶中，然后置于细胞培养箱内静置30-60min，之后向细胞培养瓶中添加间充
质干细胞无血清培养基，使培养基刚好没过绒毛膜组织块，接着于5%CO2、37℃的细胞培养
箱中静止培养，6-8天后，可见组织块周围有细胞长出，即人绒毛膜间充质干细胞；
步骤（6），人绒毛膜间充质干细胞传代培养：待长出细胞汇合率达50-60%时对人绒毛膜
间充质干细胞进行传代培养，弃培养基，加入重组细胞胰酶溶液消化细胞，待细胞消化完全
后，加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清...

【专利技术属性】
技术研发人员：闫姗姗，李一佳，甘明川，莫春红，
申请(专利权)人：云南舜喜再生医学工程有限公司，
类型：发明
国别省市：云南;53