本发明专利技术公开了一种人脂肪干细胞的分离培养方法和干细胞库的构建方法，包括以下步骤：（1）采集人脂肪组织；（2）获取和分离人脂肪干细胞；（3）干细胞培养；（4）检测、冻存；（5）建库。本发明专利技术采用D-Hanks平衡盐液配制的含有Ⅰ型和Ⅵ型胶原酶的混合胶原酶对脂肪组织进行消化，使得组织消化的更彻底，明显降低杂细胞数量和除去组织块；用含有10-15%胎牛血清、103-105U/mlLIF的MCDB-201培养液对分离后的干细胞进行培养，细胞增殖快、形态好，能有效抑制干细胞的分化，保证原代干细胞的特性，同时还能促进人脂肪干细胞的长期生长，以及保持自我更新及多向分化潜能等特点；将得到的干细胞建库保存，保证了更为优质的种子细胞来源。
【技术实现步骤摘要】
一种人脂肪干细胞的分罔培养方法和干细胞库的构建方法
本专利技术涉及人脂肪干细胞的分离培养方法及其干细胞库的构建方法，属于医学和生物学
。
技术介绍
干 细胞研究是近年来医学和生物学领域中最引人注目的热点之一。干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。通过研究他们的分化潜能，扩增能力，分化后的细胞功能以及取材是否安全方便等问题，选择最合适的干细胞源来进行组织细胞再生修复。人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells, ADSCs)是近年来从人体脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞。研究发现脂肪干细胞在特定条件下可分化为成骨细胞、软骨细胞、心肌细胞、脂肪细胞、神经细胞等，同时具有较低的免疫原性和免疫调节功能，移植同种异基因ADSCs将不会引起强烈的免疫反应和后期的排斥反应，为ADSCs的同源异体移植提供了有利条件。此外，ADSCs来源广泛，可以通过脂肪抽吸术或脂肪切除术从任何人体内获得，安全无痛苦，且在体外培养稳定，扩增速度快，不易衰老。因此，ADSCs成为目前研究的新热点，不论在再生医学还是基因治疗方面都具有重大的应用潜力。人们通过美容、肥胖过度或其他原因进行的吸脂手术或脂肪切除术，不仅能够将手术后废弃的脂肪组织通过提取分离获取所需的脂肪干细胞，达到治疗各种疾病的目的，还能通过吸脂或脂肪切除达到减肥的效果。中国专利ZL201010120944.4公开了一种“人脂肪成体干细胞的获取方法及该干细胞库的构建方法”，方便了人们有效储存和使用脂肪干细胞资源，该专利中采用I型胶原酶对脂肪组织进行消化，消化产物滤网过滤去除未消化组织块，离心后用DMEM完全培养液重悬细胞，最后接种到细胞培养瓶中培养，4-5天后换新鲜培养液，待细胞长满后消化传代；中国专利申请CN201210018269.3针对现有的细胞分离方法作了进一步的改进，采用I型、II型和IV型的混合胶原酶进行消化，该方法虽然使得消化效果有所提高，但不能够完全去除组织块和大量杂细胞；另外将细胞接种至培养瓶中培养时，使用的培养液保存不太稳定，细胞增殖较低，有一定分化，导致冻存的干细胞库中细胞的纯度仍受影响。为克服上述技术的不足，我们在实际操作中更进一步的改进和优化了脂肪干细胞的分离培养方法，使得组织消化的更彻底，明显降低杂细胞数量和除去组织块，采用的培养基具有细胞增殖快、形态好，有效抑制干细胞的分化，保证原代干细胞的特性，同时还能促进人脂肪干细胞的长期生长，以及保持自我更新及多向分化潜能等特点，从而保证了更为优质的种子细胞来源。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服以上分离提取技术的不足，而提供的一种人脂肪干细胞的分离培养方法，其具有操作简便、应用前景广阔，可为临床和研究提供大量干细胞资源的特点。本专利技术提供的人脂肪干细胞的分离培养方法中，其采用D-Hanks平衡盐溶液配制的混合胶原酶对脂肪组织进行消化，所述混合胶原酶由I型胶原酶和IV型胶原酶组成。所述混合胶原酶的1%母液配制方法为:100ml D-Hanks平衡盐溶液中加入0.7gI型胶原酶、0.3g IV型胶原酶。使用混合胶原酶消化脂肪组织时的终浓度为0.1%-0.2%(m/v)。优选终浓度为0.l%(m/v)。消化得到的脂肪干细胞在含胎牛血清的MCDB-201培养液中培养1_2天后将原有培养液吸弃，更换新鲜培养液，继续培养24h后再次换新鲜培养液。所述含胎牛血清的培养液中还含有LIF。具体地说，所述培养液是含有10-15%胎牛血清、103-105U/ml LIF的MCDB-201培养液。优选地，培养液是含有12%胎牛血清、103U/ml LIF的MCDB-201培养液。为达到上述目的，本专利技术采用了以下技术方案:一种人脂肪干细胞的分离培养方法，包括以下步骤:(I)采集人脂肪组织；(2)获取和分离人脂肪干细胞:取采集的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎成l_2mm3大小组织块，用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次至洗出液清亮，去除残留的血液，加入与脂`肪组织等体积的0.2-0.4% (m/v)混合胶原酶，在37° C温度条件下均匀震荡消化40-80分钟，再置于离心机中以1600-1800转/分钟的转速离心4-10分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复清洗，清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以1200转/分钟离心5-10分钟，弃去上清液，获得干细胞；(3)干细胞培养:将获得的干细胞按照2-3X IOVcm2的密度接种于培养瓶，加入IOmL含胎牛血清的培养液，置于37°C、C02浓度5%的培养箱中进行培养，1-2天后将原培养液吸弃，更换新鲜的含胎牛血清的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0.25%胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；(4)检测、冻存:检测和冻存同时进行，在细胞冻存过程中进行免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测等以确定其是否达到合格标准；冻存步骤为:向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，比例干细胞数/胎牛血清为1-2X106细胞/0.9mL，充分混匀，待用；在冷冻管和冷冻盒上编码；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1:1比例加入到冷冻管内混合，封盖，震荡，充分混匀，迅速移入到-80° C冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃。所述步骤(1)中，人脂肪组织是人体吸脂手术中获得的废弃物，采集至人体腹部、大腿或皮下脂肪。本专利技术的又一目的是提供上述人脂肪干细胞库的构建方法。便于人们有效储存和使用干细胞资源.构建方法包括以下步骤:(1)采集人脂肪组织；(2)获取和分离人脂肪干细胞:取采集的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎成l_2mm3大小组织块，用pH值为7.2-7.4的DHanks平衡盐液洗涤多次至洗出液清亮，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.2-0.4% (m/v)混合胶原酶，在37° C温度条件下均匀震荡消化40-80分钟，再置于离心机中以1600-1800转/分钟的转速离心4-10分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复清洗，清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以1200转/分钟离心5-10分钟，弃去上清液，获得干细胞；(3)干细胞培养:将获得的干细胞按照2-3X IOVcm2的密度接种于培养瓶，加入IOmL 含有 10-15% 胎牛血清、103-105U/ml LIF 的 MCDB-201 培养液，置于 37°C、C02 浓度 5%的培养箱中进行培养，1-2天后将原培养液吸弃，更换新鲜的含胎牛血清的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0.25%胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；(4)检测、冻存:检测和冻存同时进行，在细胞冻存过程中进行免疫表本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）采集人脂肪组织；（2）获取和分离人脂肪干细胞：取采集的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎成1?2mm3大小组织块，用pH值为7.2?7.4的D?Hanks平衡盐液洗涤多次至洗出液清亮，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.2?0.4%（m/v）混合胶原酶，在37°C温度条件下均匀震荡消化40?80分钟，再置于离心机中以1600?1800转/分钟的转速离心4?10分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2?7.4的D?Hanks平衡盐液反复清洗，清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以1200转/分钟离心5?10分钟，弃去上清液，获得干细胞；（3）干细胞培养：将获得的干细胞按照2?3×104/cm2的密度接种于培养瓶，加入10mL含胎牛血清的培养液，置于37℃、CO2浓度5％的培养箱中进行培养，1?2天后将原培养液吸弃，更换新鲜的含胎牛血清的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0.25%胰酶?EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞；（4）检测、冻存：检测和冻存同时进行，在细胞冻存过程中进行免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测等以确定其是否达到合格标准；冻存步骤为：向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，比例干细胞数/胎牛血清为1?2×106细胞/0.9mL，充分混匀，待用；在冷冻管和冷冻盒上编码；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1：1比例加入到冷冻管内混合，封盖，震荡，充分混匀，迅速移入到?80°C冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃。...
【技术特征摘要】
1.一种人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)采集人脂肪组织； (2)获取和分离人脂肪干细胞:取采集的脂肪组织，剔除脂肪中肉眼可见的血管和纤维部分，剪碎成l_2mm3大小组织块，用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液洗涤多次至洗出液清亮，去除残留的血液，加入与脂肪组织等体积的0.2-0.4% (m/v)混合胶原酶，在37° C温度条件下均匀震荡消化40-80分钟，再置于离心机中以1600-1800转/分钟的转速离心4-10分钟，去除表层脂肪，将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复清洗，清洗下来的液体经100目筛网过滤，去除未消化组织，将滤液以1200转/分钟离心5-10分钟，弃去上清液，获得干细胞； (3)干细胞培养:将获得的干细胞按照2-3XIOVcm2的密度接种于培养瓶，加入IOmL含胎牛血清的培养液，置于37°C、C02浓度5%的培养箱中进行培养，1-2天后将原培养液吸弃，更换新鲜的含胎牛血清的培养液，弃去非贴壁细胞，以后每24小时更换培养液一次，待细胞生长达到80%融合，在培养瓶中加0.25%胰酶-EDTA进行消化，按1:3传代，获得传代培养后的人脂肪干细胞； (4)检测、冻存:检测和冻存同时进行，在细胞冻存过程中进行免疫表型检测、细胞计数及活力测定、生物学效力检测、细胞分化能力检测等以确定其是否达到合格标准；冻存步骤为:向获得的人脂肪成体干细胞中加入胎牛血清，比例干细胞数/胎牛血清为1-2 X IO6细胞/0.9mL，充分混匀，待用；在冷冻管和 冷冻盒上编码；将上述人脂肪成体干细胞悬液与冻存液按照1:1比例加入到冷冻管内混合，封盖，震荡，充分混匀，迅速移入到-80° C冰箱内；24小时后，按照编号放到相应冷冻架上移入液氮中长期保存，待检测结果出来之后，将检测不合格的细胞按照其编号将相应的冻存细胞连同冻存管一同废弃。2.根据权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于:人脂肪组织是人体吸脂手术或脂肪切除术中获得的废弃物，采集至人体腹部、大腿或皮下脂肪。3.根据权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于:混合胶原酶是以D-Hanks平衡盐溶液配制的混合胶原酶，所述混合胶原酶由I型胶原酶和IV型胶原酶组成。4.根据权利要求3所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于:所述混合胶原酶的1% (m/v)母液配制方法为:100ml D-Hanks平衡盐溶液中加入0.7g I型胶原酶、0.3g IV型胶原酶。5.根据权利要求1所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，其特征在于:使用所述混合胶原酶消化脂肪组织时的终浓度为0.1%-0.2% (m/v)。6.根据权利要求5所述的人脂肪干细胞的分离培养方法，...
【专利技术属性】
技术研发人员：张芝庭，
申请(专利权)人：贵州神奇集团控股有限公司，
类型：发明
国别省市：
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