脂肪间充质干细胞的培养方法技术

本发明专利技术提供了一种脂肪间充质干细胞的培养方法。本发明专利技术脂肪间充质干细胞培养方法包括如下培养步骤：将获取的原代脂肪间充质干细胞接种至干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素3因子，且所述干细胞因子与白介素3因子的含量比为(5‑20μmol/L):(5‑20ug/ml)。本发明专利技术培养方法能够提高脂肪间充质干细胞的扩增能力，并获得较高的迁移能力。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种脂肪间充质干细胞的培养方法。
技术介绍
间充质干细胞(MesenchymalStemCells,MSCs)最早发现于骨髓，现已被证实存在于机体的多种组织器官中，是一群具有多向分化潜能的多能干细胞。与其他来源MSCs相比，脂肪来源间充质干细胞(adiposederivedstromalcells,ADSCs)在分离培养上有很大优势：(1)取材方便。脂肪组织储备丰富，取材痛苦小。目前一次吸脂术可获得200ml脂肪，分离出约1×106个干细胞，为骨髓分离量的40倍；(2)分离简单。外周脂肪经机械剪切，胶原酶消化和简单梯度离心就可获得ADSCs。但在目前实际应用过程中，脂肪间充质干细胞的培养存在扩增能力有限、迁移性差等问题。干细胞的迁移性已被证实与干细胞的分化能力和损伤修复能力密切相关，因此，寻找一种新的脂肪间充质干细胞培养方法以促进其增殖、提高其迁移能力是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术实施例的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种脂肪间充质干细胞的培养方法，以解决现有脂肪间充质干细胞的培养存在扩增能力有限、迁移性差等技术问题。为了实现上述专利技术目的，作为本专利技术的一方面，提供了一种脂肪间充质干细胞的培养方法。所述脂肪间充质干细胞的培养方法将获取的原代脂肪间充质干细胞接种至干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素3因子，且所述干细胞因子与白介素3因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。与现有技术相比，本专利技术脂肪间充质干细胞的培养方法通过在干细胞培养基中添加干细胞因子和白介素3因子，并控制两因子含量比，使得两细胞因子产生对脂肪间充质干细胞生长和增殖的协效作用，从而提高脂肪间充质干细胞在培养过程中的扩增能力，并获得较高的迁移能力，有效解决了传统脂肪间充质干细胞培养方法存在的扩增能力有限、迁移性差的问题，为临床应用脂肪间充质干细胞进行组织损伤修复提供了优良的种子。在干细胞因子和白介素3因子协效作用的基础上，通过在培养方法中增设的含有纤连蛋白包被液的包被处理，使得纤连蛋白与干细胞因子和白介素3因子之间进一步产生协效作用，从而提高脂肪间充质干细胞在培养过程中的的增殖以及迁移能力。附图说明下面将结合附图及实施例对本专利技术作进一步说明，附图中：图1为实施例1重组质粒pET-30a-rhIL-3酶切鉴定琼脂糖凝胶电泳图；其中，M:DNAladder；1～3：质粒pET-30a-rhIL-3用NdeI和XhoI进行酶切；图2为实施例1中rhIL-3在菌株BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3中诱导表达结果的SDS-PAGE检测图；其中，1：未经IPTG诱导的BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3菌体总蛋白；2：IPTG诱导后的1#BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3菌体总蛋白；3：IPTG诱导后的2#BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3菌体总蛋白；4：购买的商业化IL-3样本；M：蛋白质Marker；图3为实施例1中离子交换层析后的目的IL-3重组蛋白的SDS-PAGE检测图；其中，M：蛋白Marker；1：IPTG诱导后的BL21(DE3)pET-30a-rhIL-3菌体总蛋白；2：300mmolNaCl洗脱物1#管；3：300mmolNaCl洗脱物2#管；图4为实施例1-2和对比实施例1-3各实施例培养的ADSC生长曲线图；图5为实施例1和对比实施例3培养的ADSC表型流式检测图；其中图5A为间充质干细胞表面抗原表达流式图，图5B为造血细胞标志物表达流式图；图6为实施例1和对比实施例3培养的ADSC周期的流式检测图；其中图6A为Ctr-ADSC细胞周期的流式检测图；图6B为F/S/I-ADSC细胞周期的流式检测图；图6C为Ctr-ADSC细胞和F/S/I-ADSC细胞周期流式检测结果统计图；图7为实施例1和对比实施例3培养的ADSC迁移性检测图；其中图7A为Ctr-ADSC细胞迁移轨迹跟踪图；图7B为F/S/I-ADSC细胞迁移轨迹跟踪图；图7C为Ctr-ADSC细胞和F/S/I-ADSC细胞迁移平均速度统计图。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。相关专业词汇说明：纤连蛋白(Fibronectin，FN)：高分子量(～440kDa)的糖蛋白细胞外基质，和细胞膜内称为整合素的受体蛋白结合。干细胞因子(StemCellFactor，SCF)：酪氨酸激酶受体c-Kit的配体。白介素3(Interleukin3，IL-3)：一种多效性的细胞因子，主要由激活了的T细胞、巨噬细胞和骨髓基质干细胞产生，通过与其受体IL-3R结合，诱导JAK-STAT5信号通路的激活，控制DNA合成，调控细胞周期进程。IPTG：异丙基硫代半乳糖苷，是一种作用极强的诱导剂。一方面，本专利技术实施例提供了一种能够有效提高脂肪间充质干细胞增殖和迁移的脂肪间充质干细胞培养方法。本实施例脂肪间充质干细胞培养方法含有如下步骤：将获取的原代脂肪间充质干细胞接种至干细胞培养基中进行培养处理。在步骤中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素3因子，且控制所述干细胞因子与白介素3因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。通过在培养基中添加干细胞因子与白介素3因子，并控制两因子的含量比例，使得两因子在脂肪间充质干细胞的扩增中发挥协效作用，从而提高脂肪间充质干细胞在培养过程中的扩增能力，并获得较高的迁移能力。在一实施例中，控制干细胞因子在所述干细胞培养基中的浓度为5-20μmol/ml。当然在干细胞因子和白介素3因子含量比例明确的前提下，明确了干细胞因子在所述干细胞培养基中的浓度，也就明确了白介素3在所述干细胞培养基中的浓度。通过优化控制干细胞因子和白介素3在所述干细胞培养基中的浓度，能够进一步提高干细胞因子与白介素3因子的协效作用，从而进一步提高脂肪间充质干细胞的扩增能力和迁移能力。在上述实施例的基础上，在一实施例中，白介素3因子为重组人IL-3，具体是经优化后的人全长IL-3基因为靶基因进行诱导后的重组人IL-3。其中，人全长IL-3基因序列为GenBank数据库记录的人全长IL-3基因序列，所述优化后的人全长IL-3基因序列是针对GenBank数据库记录的人全长IL-3基因序列进行的优化。在具体实施例中，所述优化后的人全长IL-3基因序列如下：5'-ATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCCCGGACTCCAAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAGACAAGCTGGGTTAACTGCTCTAACATGATCGATGAAATTATAACACACTTAAAGCAGCCACCTTTGCCTTTGCTGGACTTCAACAACCTCAATGGGGAAGACCAAGACATTCTGATGGAAAATAACCTTCGAAGGCCAAACCTGGAGGCATTCAACAGGGCTGT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下培养步骤：将获取的原代脂肪间充质干细胞接种至干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素3因子，且所述干细胞因子与白介素3因子的含量比为(5‑20μmol/L):(5‑20ug/ml)。

【技术特征摘要】
1.一种脂肪间充质干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下培养步骤：将获取的原代脂肪间充质干细胞接种至干细胞培养基中进行培养处理，其中，所述干细胞培养基中含有干细胞因子和白介素3因子，且所述干细胞因子与白介素3因子的含量比为(5-20μmol/L):(5-20ug/ml)。2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于：所述培养处理是在被包被处理的培养器中进行，所述包被处理的包被液含有纤连蛋白。3.根据权利要求2所述的培养方法，其特征在于：所述纤连蛋白在所述包被液中的浓度为5-20μg/ml。4.根据权利要求1-3任一所述的培养方法，其特征在于：所述白介素3因子是以经优化后的人全长IL-3基因为靶基因进行诱导后的重组人IL-3，所述优化后的人全长IL-3基因序列如下：5'-ATGAGCCGCCTGCCCGTCCTGCTCCTGCTCCAACTCCTGGTCCGCCCCGGACTCCAAGCTCCCATGACCCAGACAACGCCCTTGAAGACAAGCTGGGTTAACTGCTCTAACATGATCGATGAAATTAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玮，覃绍君，陈瑞华，
申请(专利权)人：海南博鳌一龄迈迪精准医学研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：海南;46