用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基制造技术

本发明专利技术涉及用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基，属于干细胞分化技术领域。在本发明专利技术中，所述培养基包括消化酶溶液、脂肪来源间充质干细胞培养基、同步化培养基、诱导分化培养基和成熟培养基。本发明专利技术还提供了体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的试剂盒，以及所述培养基和试剂盒在体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞中的应用。本发明专利技术提供的培养基能够实现脂肪来源间充质干细胞的大规模生产，且实现体外诱导脂肪来源间充质干细胞高效分化为肝细胞，操作简便、成本低。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及干细胞分化
，尤其涉及用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基。
技术介绍
随着近年来组织工程研究的进展，干细胞移植治疗晚期肝病已经成为最具前景的发展方向。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是干细胞家族的重要成员，因具有多向分化潜能、造血支持、免疫调控和自我复制等特点，日益受到人们的关注。间充质干细胞具有多向分化潜能，可分化为多种组织细胞，进而发挥替代、修复组织的作用。利用MSCs诱导分化为肝细胞进而移植修复肝脏，已成为极具前景的治疗肝病的新方法。目前诱导MSCs向肝细胞分化技术含有：改变干细胞生长的环境，如联合使用细胞因子、小分子化合物、细胞基质等，但如何恰当搭配各种因素促进诱导分化效率仍是一个问题；利用基因转移技术改造细胞，但存在致瘤性等安全性问题；蛋白转导技术，采用病毒载体介导蛋白基因转入细胞，但存在转染效率不高的问题。常用的细胞因子组合培养体系包括了成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)和表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)，使用的细胞因子多，成本较高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基。本专利技术的培养基能够很好地应用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的试剂盒的制备和体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的过程中。本专利技术的培养基能够实现脂肪来源间充质干细胞的大规模生产，且实现体外诱导脂肪来源间充质干细胞高效分化为肝细胞，操作简便、成本低。本专利技术提供了用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基，包括消化酶溶液、脂肪来源间充质干细胞培养基、同步化培养基、诱导分化培养基和成熟培养基；所述消化酶溶液包含0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶、0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶、1～3U/ml硫酸软骨素酶和余量的水；所述脂肪来源间充质干细胞培养基为含有10～20％体积分数胎牛血清的DMEM培养基；所述同步化培养基为无血清的IMDM培养基；所述诱导分化培养基包含10～15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、2～5％体积分数的胎牛血清、20～40ng/ml肝细胞生长因子和1～5μM维甲酸的IMDM培养基；所述成熟培养基为包含2～5％体积分数的胎牛血清、10～30ng/ml抑瘤素M、1～2μM地塞米松和1～5％体积分数的胰岛素-转铁蛋白-硒的IMDM培养基。优选的是，所述消化酶溶液包含等体积的0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶、0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶和1～3U/ml硫酸软骨素酶。优选的是，所述碱性成纤维细胞生长因子为FGF4。优选的是，所述胰岛素-转铁蛋白-硒为包括8～12μg/ml胰岛素、4.5～6.5μg/ml转铁蛋白和6～7.5ng/ml亚硒酸钠的水溶液。本专利技术还提供了一种用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的试剂盒，包含权利要求1～4任意一项所述的培养基，所述培养基以液态进行分装，所述培养基在2～8℃进行保存。本专利技术还提供了权利要求1～4任意一项所述培养基或权利要求4所述试剂盒在体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞中的应用。本专利技术还提供了一种体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的方法，包括以下步骤：采用消化酶溶液对脂肪组织进行消化，将所述消化后的细胞加入到脂肪来源间充质干细胞培养基中进行原代培养，得到原代培养脂肪来源间充质干细胞；将所述原代培养脂肪来源间充质干细胞置于脂肪来源间充质干细胞培养基中进行传代扩增培养，得到第3～5代脂肪来源间充质干细胞；将所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞置于同步化培养基中进行同步化培养，得到周期同步化的细胞；将所述周期同步化的细胞置于诱导分化培养基中进行诱导分化培养，得到分化后的细胞；将所述分化后的细胞置于成熟培养基中进行成熟培养，得到成熟的肝细胞。优选的是，由所述脂肪组织培养至所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞的过程具体为：采用磷酸盐缓冲溶液清洗脂肪组织；将所述清洗后的脂肪组织与消化酶溶液按1:2体积比混合进行消化，所述消化的时间为25～40min，每8～12min进行摇晃；将所述消化后的脂肪组织过200～400目筛网，1000～1500rpm离心5～10min，去除上层液体，得到细胞沉淀；将所述细胞沉淀用含10％体积分数胎牛血清的DMEM培养基重悬后接种于培养皿中进行原代培养，得到原代培养脂肪来源间充质干细胞；将所述原代培养脂肪来源间充质干细胞，加入0.2～0.4％质量体积分数的胰酶进行消化，传代扩增培养；当传代扩增培养的细胞单层汇合80％时，继续传代培养，得到第3～5代脂肪来源间充质干细胞。优选的是，将所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞培养为成熟肝细胞的具体过程包括以下步骤：将所述第3～5代脂肪来源间充质干细胞置于同步化培养基中，继续同步化培养2～4天，得到周期同步化的细胞；将所述周期同步化的细胞加入到诱导分化培养基中进行诱导分化培养，培养6～8天得到分化后的细胞；将所述分化后的细胞加入到成熟培养基中，成熟培养14～21天，得到成熟的肝细胞。本专利技术提供的培养基包括消化酶溶液、脂肪来源间充质干细胞培养基、同步化培养基、诱导分化培养基和成熟培养基。本专利技术提供的培养基能够应用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的过程中。获得的脂肪来源间充质干细胞数量多，细胞量为常规方法的2倍以上，且细胞活力达到98％以上；本专利技术提供的培养基诱导效率高，操作简单，诱导过程无需进行基因转染或病毒介导方法，仅需添加细胞因子和分子化合物等；成本低，仅需使用成纤维细胞生长因子和肝细胞生长因子两种细胞因子。实现了在体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞中的高效应用。附图说明图1是实施例3提供的脂肪来源间充质干细胞培养过程中的细胞形态观察示意图；图2是实施例3提供的第3代脂肪来源间充质干细胞流式细胞仪检测结果图；图3是实施例3提供的第3代脂肪来源间充质干细胞诱导分化为成熟肝细胞过程中形态观测结果图；图4是实施例3提供的第3代脂肪来源间充质干细胞与成熟肝细胞的细胞表面ALB的表达情况图；图5是实施例3提供的第3代脂肪来源间充质干细胞与成熟肝细胞的过碘酸雪夫染色结果图。具体实施方式本专利技术提供了用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基，包括消化酶溶液、脂肪来源间充质干细胞培养基、同步化培养基、诱导分化培养基和成熟培养基；所述消化培养基包含0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶、0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶、1～3U/ml硫酸软骨素酶和余量的水；所述脂肪来源间充质干细胞培养基为含有10～20％体积分数胎牛血清的DMEM培养基；所述同步化培养基为无血清的IMDM培养基；所述诱导分化培养基包含10～15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、2～5％体积分数的胎牛血清、20～40ng/ml肝细胞生长因子和1～5μM维甲酸的IMDM培养基；所述成熟培养基为包含2～5％体积分数的胎牛血清、10～30ng/ml抑瘤素M、1～2μM地塞米松和1～5％体积分本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基，其特征在于，包括消化酶溶液、脂肪来源间充质干细胞培养基、同步化培养基、诱导分化培养基和成熟培养基；所述消化酶溶液包含0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶、0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶、1～3U/ml硫酸软骨素酶和余量的水；所述脂肪来源间充质干细胞培养基为含有10～20％体积分数胎牛血清的DMEM培养基；所述同步化培养基为无血清的IMDM培养基；所述诱导分化培养基包含10～15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、2～5％体积分数的胎牛血清、20～40ng/ml肝细胞生长因子和1～5μM维甲酸的IMDM培养基；所述成熟培养基为包含2～5％体积分数的胎牛血清、10～30ng/ml抑瘤素M、1～2μM地塞米松和1～5％体积分数的胰岛素‑转铁蛋白‑硒的IMDM培养基。

【技术特征摘要】
1.用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的培养基，其特征在于，包括消化酶溶液、脂肪来源间充质干细胞培养基、同步化培养基、诱导分化培养基和成熟培养基；所述消化酶溶液包含0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶、0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶、1～3U/ml硫酸软骨素酶和余量的水；所述脂肪来源间充质干细胞培养基为含有10～20％体积分数胎牛血清的DMEM培养基；所述同步化培养基为无血清的IMDM培养基；所述诱导分化培养基包含10～15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、2～5％体积分数的胎牛血清、20～40ng/ml肝细胞生长因子和1～5μM维甲酸的IMDM培养基；所述成熟培养基为包含2～5％体积分数的胎牛血清、10～30ng/ml抑瘤素M、1～2μM地塞米松和1～5％体积分数的胰岛素-转铁蛋白-硒的IMDM培养基。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述消化酶溶液包含等体积的0.1～0.2％质量浓度的I型胶原酶、0.1～0.2％质量浓度的透明质酸酶和1～3U/ml硫酸软骨素酶。3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述碱性成纤维细胞生长因子为FGF4。4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述胰岛素-转铁蛋白-硒为包括8～12μg/ml胰岛素、4.5～6.5μg/ml转铁蛋白和6～7.5ng/ml亚硒酸钠的水溶液。5.一种用于体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的试剂盒，包含权利要求1～4任意一项所述的培养基，所述培养基以液态进行分装，所述培养基在2～8℃进行保存。6.权利要求1～4任意一项所述培养基或权利要求4所述试剂盒在体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞中的应用。7.一种体外诱导脂肪来源间充质干细胞分化为肝细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：采用消化酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜舒，纪惜銮，张芸，杨顺，罗朝霞，
申请(专利权)人：深圳市茵冠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44