本发明专利技术涉及一种诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法。为解决现有技术分化率低问题。步骤有：1)、脂肪间充质干细胞原代细胞的分离：2)、脂肪间充质干细胞扩增、传代：3)、P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养：脂肪间充质干细胞在传P5代后加入条件培养基，即脂肪间充质干细胞向软骨分化培养基，进行向软骨细胞分化培养，每三天进行细胞换液，同时观察了细胞的形态学变化，诱导16天后进行阿利新蓝染色鉴定脂肪间充质干细胞成软骨分化情况。阿利新兰染色鉴定是显微镜下可见软骨细胞形成，且阿利新蓝染色呈阳性。具有简单易行，诱导培养基为无血清培养系统，诱导时间短，实验重复性好，成骨细胞分化率高的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种干细胞诱导分化方法，特别是涉及一种诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法。
技术介绍
关节软骨是一种特殊形式的结缔组织，属透明软骨，主要由软骨细胞和细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)组成，其功能是减轻关节运动作用于软骨下骨的压力并减少关节面的摩擦。由于软骨组织没有血液供应，只能依靠关节液提供营养，因此，一旦软骨组织发生损伤则难以通过激活血液或骨髓里的祖细胞进入缺损处进行修复，损伤很难自愈。传统的关节软骨修复方法主要是通过调动软骨细胞内在的愈合潜能促进软骨愈合或者通过促进软骨细胞再生来修复软骨缺损。间充质干细胞(mesenchymalstemcells，MSCs)MSCs来源于中胚层，存在于成人多种组织中，包括滑膜、肌肉、脂肪、骨髓等，除了具有高度自我更新能力外，体外可以分化成脂肪细胞、软骨细胞、骨细胞、神经细胞等。脂肪间充质干细胞ADSCs具有多向分化潜能，无免疫原性，而且来源丰富、取材方便、创伤性小、干细胞含量高、能重复提取，所获得细胞数量多，可不经过体外扩增直接应用。另外，脂肪间充质干细胞ADSCs比骨髓间充质干细胞BMSCs高表达趋化因子受体，有利于干细胞的迁移和归巢，维持内环境的稳定和介导损伤修复。与高分化的软骨细胞相比，间充质干细胞具有自我更新和“可塑性”，自身来源的ADSCs几乎没有免疫原性，成为组织工程种子细胞的研究热点。ADSCs还能自分泌功能性细胞因子，包括诱导软骨形成的分子，如TGF-β、BMP4、FGF等促进分化。
技术实现思路
本专利技术目的在于克服现有技术的上述缺陷，提供一种能将脂肪间充质干细胞高效分化为软骨细胞的诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法。为实现上述目的，本专利技术诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法步骤有：1)、脂肪间充质干细胞原代细胞的分离：吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平a板检测，确保实验前脂肪无污染；离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物，37℃消化30-45分钟后停止酶解，离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪间充质干细胞悬液；2)、脂肪间充质干细胞扩增、传代：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4--1∶6接种到新培养瓶中培养，在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞：细胞生长达到80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用自体血清终止消化，将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，倒掉离心后的上清，以1∶3的比例传代，培养至P4代；3)、P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养：(1)取P4代细胞生长达到70-80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用人血清终止消化，将细胞收集到离心管中，充分混匀后，离心，倒掉离心后的上清，加入DPBS洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入DPBS洗液，混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，离心后去掉上清；备用做脂肪干细胞向软骨细胞分化培养；(2)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度；将细胞悬液加入多孔板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24小时后，换加入诱导分化培养基，每三天更换一次诱导分化培养基；16-18天后，进行阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合格后，完成向软骨细胞分化的培养；所述诱导分化培养基为由DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，10ng/ml的转化生长因子-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50ug/ml，地塞米松10-7mol/L，丙酮酸钠6.25ug/ml，维生素C浓度25ug/mL配制成的无血清诱导培养液。具有简单易行，诱导培养基为无血清培养系统，诱导时间短，实验重复性好，成骨细胞分化率高的特点。作为优化，步骤1)中的吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织是无菌条件下打开样本存储装置，将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织；加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物是按照相应比例加入加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物；离心弃去上清液是1500rpm离心10分钟，弃去上清液；用筛网过滤是用200目筛网过滤。作为优化，步骤2)中：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中是获得的细胞按2-3×104/cm2的密度接种到培养瓶中；在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞是在每个75cm2培养瓶中加入12ml间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞；用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶-EDTA进行消化是用DPBS洗液洗两遍后，加入3ml胰酶-EDTA进行消化；用自体血清终止消化是用2ml自体血清终止消化；将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心是，将细胞吸入50毫升离心管中，充分混匀后，取100微升计数，其余细胞悬液离心，1500rpm，维持10min。作为优化，子步骤(1)中：用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化是用DPBS洗液洗两遍后，加入3mltrypLETM进行消化；用人血清终止消化是用2ml人血清终止消化；将细胞收集到离心管中是将细胞收集到50毫升离心管中；离心是1500rpm，离心10min；加入DPBS洗液的量为40ml。作为优化，子步骤(2)中：用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度是用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度至1.5×107细胞/ml；将细胞悬液加入多孔板中是将1ml含有1.5×107个细胞的细胞悬液取5ul加入96孔板中；阿利新兰染色鉴定是阿利新蓝染色检测蛋白多糖的分泌从而鉴定脂肪间充质干细胞成软骨分化情况。作为优化，子步骤(2)中：阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况是定向诱导培养16-18天后，用低聚甲醛固定在多孔板中细胞后行以下检测：阿利新蓝染色是用阿利新蓝染色，蒸馏水冲洗，苏木精染核，无水乙醇脱水，在倒置相差显微镜下观察染色情况。作为优化，用低聚甲醛固定在多孔板中细胞后行以下检测是用4％低聚甲醛固定24孔板中细胞20min后行以下检测；阿利新蓝染色是用阿利新蓝染色，蒸馏水冲洗，苏木精染核是用pH2.5的阿利新蓝染色30min，蒸馏水冲洗15min，苏木精染核；无水乙醇脱水，室温下待干，在倒置相差显微镜下观察染色情况，镜下记录并拍照。作为优化，子步骤(2)中：间充质干细胞生长培养基是每T75培养瓶加10ml专用培养基，专用培养基由D/F12，血清替代物，BFGF，1％的双抗配制而成。作为优化，吸脂来源的脂肪组织是从人臀部吸脂来源的脂肪组织。作为优化，阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于步骤有：1)、脂肪间充质干细胞原代细胞的分离：吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平a板检测，确保实验前脂肪无污染；离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物，37℃消化3045分钟后停止酶解，离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪问充质干细胞悬液；2)、脂肪间充质干细胞扩增、传代：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80‑90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4‑‑1∶6接种到新培养瓶中培养，在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞：细胞生长达到80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶‑EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用自体血清终止消化，将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，倒掉离心后的上清，以1∶3的比例传代，培养至P4代；3)、P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养：(1)取P4代细胞生长达到70‑80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用人血清终止消化，将细胞收集到离心管中，充分混匀后，离心，倒掉离心后的上清，加入DPBS洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入DPBS洗液，混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，离心后去掉上清；备用做脂肪干细胞向软骨细胞分化培养；(2)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度；将细胞悬液加入多孔板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24小时后，换加入诱导分化培养基，每三天更换一次诱导分化培养基；16‑18天后，进行阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合格后，完成向软骨细胞分化的培养；所述诱导分化培养基为由DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，10ng/ml的转化生长因子‑β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50ug/ml，地塞米松10‑7mol/L，丙酮酸钠6.25ug/ml，维生素C浓度25ug/mL配制成的无血清诱导培养液。...
【技术特征摘要】
1.一种诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的培养方法，其特征在于步骤有：1)、脂肪间充质干细胞原代细胞的分离：吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织，同时对脂肪进行涂平a板检测，确保实验前脂肪无污染；离心后脂肪组织在下层，去掉上层血水后将离心管下层的脂肪分散，加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物，37℃消化3045分钟后停止酶解，离心弃去上清液；并用筛网过滤，得脂肪问充质干细胞悬液；2)、脂肪间充质干细胞扩增、传代：获得的脂肪间充质干细胞接种到培养瓶中，置于37℃、饱和湿度、5％的CO2培养箱中进行原代细胞培养，细胞培养到80-90％融合时，用trypLETM消化，按分种率1∶4--1∶6接种到新培养瓶中培养，在培养瓶中加入间充质干细胞生长培养基培养P4代脂肪源间充质干细胞：细胞生长达到80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入胰酶-EDTA进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用自体血清终止消化，将细胞吸入离心管中，充分混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，倒掉离心后的上清，以1∶3的比例传代，培养至P4代；3)、P5代脂肪干细胞向软骨细胞分化培养：(1)取P4代细胞生长达到70-80％融合，用DPBS洗液洗多遍后，加入trypLETM进行消化，显微镜下观察，细胞呈现圆球状态时，用人血清终止消化，将细胞收集到离心管中，充分混匀后，离心，倒掉离心后的上清，加入DPBS洗液，混匀后再次离心，倒掉上清，再次加入DPBS洗液，混匀后，取样计数，其余细胞悬液离心，离心后去掉上清；备用做脂肪干细胞向软骨细胞分化培养；(2)用间充质干细胞生长培养基重悬细胞，调整细胞浓度；将细胞悬液加入多孔板中，放入37℃，5％CO2细胞培养箱中，约24小时后，换加入诱导分化培养基，每三天更换一次诱导分化培养基；16-18天后，进行阿利新兰染色鉴定和倒置显微镜下观察细胞生长状况合格后，完成向软骨细胞分化的培养；所述诱导分化培养基为由DMEM高糖培养液，5％血清替代物，100u/ml青霉素，100g/ml链霉素，10ng/ml的转化生长因子-β1，转铁蛋白5μg/ml，抗坏血酸50ug/ml，地塞米松10-7mol/L，丙酮酸钠6.25ug/ml，维生素C浓度25ug/mL配制成的无血清诱导培养液。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于步骤1)中的吸脂来源的脂肪组织洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织是无菌条件下打开样本存储装置，将吸脂来源的脂肪组织用D.Hanks冲洗，洗去血细胞和混合的少量纤维结缔组织；加入2倍体积I型胶原酶和trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物是按照相应比例加入加入2倍体积的0.1％I型胶原酶和0.25％trypLETM消化酶溶液混合物溶液混合物；离心弃去上清液是1500rpm离心10分钟，...
【专利技术属性】
技术研发人员：李亚平，王晶，谷广其，邱丽媛，房芳，熊开宇，何辉，吴志宏，赵进军，何文丽，
申请(专利权)人：中卫华医北京生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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