一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其步骤如下：一、取含油土壤放入三角瓶中，摇匀，静止至完全沉降；二、取上清液接入含有基础培养液的三角瓶中，富集培养；三、取富集培养液接入含有基本培养液的三角瓶中，震荡培养；四、将培养液倍比稀释，取培养液涂布在含基本培养基的固体平板上，将平板放在培养箱中培养直至长出菌落；五、将单菌落划线纯化后进行低温氨氮降解试验，即可得到石油产品脱硫菌株。本发明专利技术筛选出的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌能够广泛降解石油产品中的DBT，对降低空气污染和酸雨以及生态环境修复具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，涉及一种巨大芽孢杆菌的筛选方法。
技术介绍
在环境法规所要求的硫含量变得越来越低的同时，世界上大多数国家对汽油和柴油的需求量却在持续增加。硫主要以杂环化合物的形式存在于化石燃料中，包括二甲基亚砜、噻吩、二苯并噻吩(DBT)及其他噻吩。化石燃料燃烧后，硫主要以SO2形式排入大气，不仅腐蚀设备，还会对空气造成严重污染，甚至形成酸雨。因此，世界各国都制定了日益严格的环保法规对清洁燃料的生产提出了更为苛刻的要求。解决这一问题的重要途径之一是对油品进行深度脱硫，传统的加氢脱硫方法(HDS)成本较高，需要高温高压条件，操作较困难，而且去除噻吩及其衍生物的杂环硫成本较高。因此，HDS已经难以满足日益严格的脱硫要求。生物脱硫是在温和的反应条件下，以酶为催化剂，首先在细菌帮助下，将有机硫化物分子从油中转移到细胞中，然后在酶的作用下发生氧化反应，除去有机硫化物。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，该方法筛选出的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌能够广泛降解石油产品中的DBT，对降低空气污染和酸雨以及生态环境修复具有重要意义。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的：一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，包括如下步骤：一、取80～120g含油土壤放入500mL三角瓶中，摇匀，静止至完全沉降；二、取上清液接入含有80～120mL基础培养液的250mL三角瓶中，25～35℃，150～200r/min富集培养5～10天；三、取1～5mL富集培养液接入含有100mL基本培养液的三角瓶中，3个平行样，20～40℃，150～200r/min震荡培养3～5天；四、将培养液倍比稀释至1000倍，取100μL培养液涂布在含基本培养基的固体平板上，将平板放在20～40℃培养箱中培养直至长出菌落；五、将单菌落划线纯化后进行低温氨氮降解试验，即可得到石油产品脱硫菌株。本专利技术中，所述基本培养液由6.0～10.0g/L葡萄糖、2.0～3.0g/LNH4Cl、6.0～7.0g/LKH2PO4、8.0～9.0g/LK2HPO4、0.2～0.4g/LMgCl2·6H2O、0.5～1.5mL/L微量元素溶液母液、0.5～1.5mL/L维生素溶液母液和余量的蒸馏水组成，总体积为100mL，121℃灭菌30min。本专利技术中，所述微量元素母液由0.6～1.0g/LFeCl2·4H2O、0.6～1.0g/LZnCl2、0.6～1.0g/LMnCl2·4H2O、0.1～0.3g/LNaMoO4·2H2O、0.06～0.10g/LCuCl2、0.06～0.10g/LNaWO4·2H2O和140～160mmol/LHCl组成。本专利技术中，所述维生素母液由400～600mg/L泛酸钙、200～400mg/L肌醇、400～600mg/L烟酸、400～600mg/L盐酸吡哆醇、200～400mg/L对氨基甲苯和0.6～0.8mg/L维生素B12组成。本专利技术中，所述基本培养基由基本培养液和琼脂组成。本专利技术具有如下优点：1、本专利技术筛选得到的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌可以在常温条件下降解石油产品中的DBT，48h对DBT降解率为40～50％。2、本专利技术筛选得到的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌为好氧菌，可在30℃条件下进行好氧脱硫反应，可独立高效完成石油产品脱硫全过程。初始二苯并噻吩为50mg/L，30℃，48h能够将40～50％的二苯并噻吩转化为2-羟基联苯。3、本专利技术筛选得到的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌能够广泛降解石油产品中的DBT，降低空气污染和酸雨以及生态环境修复具有重要意义。附图说明图1为石油产品脱硫巨大芽孢杆菌在培养基上的菌落形态图；图2为石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的系统进化树图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本专利技术技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本专利技术技术方案的精神和范围，均应涵盖在本专利技术的保护范围中。本专利技术提供了一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，该石油产品脱硫巨大芽孢杆菌是从黑龙江省大庆油田含油土壤中分离筛选得到，具体筛选过程如下：一、取100g含油土壤放入500mL三角瓶中，摇匀，静止至完全沉降；二、取上清液接入含有100mL基础培养液的250mL三角瓶中，30℃，160r/min富集培养5天；三、取1mL富集培养液接入含有100mL基本培养液的三角瓶中，3个平行样，30℃，160r/min震荡培养3天；四、将培养液倍比稀释至1000倍，取100μL培养液涂布在含基本培养基的固体平板上，将平板放在30℃培养箱中培养直至长出菌落；五、将单菌落划线纯化后进行低温氨氮降解试验，即可得到石油产品脱硫菌株，该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillusmegatherium)HNHHJ-1。本专利技术中，所述基本培养液由8.0g/L葡萄糖、2.5g/LNH4Cl、6.5g/LKH2PO4、8.5g/LK2HPO4、0.3g/LMgCl2·6H2O、1.0mL/L微量元素溶液母液、1.0mL/L维生素溶液母液和余量的蒸馏水组成，总体积为100mL，121℃灭菌30min。本专利技术中，所述微量元素母液由0.8g/LFeCl2·4H2O、0.8g/LZnCl2、0.8g/LMnCl2·4H2O、0.2g/LNaMoO4·2H2O、0.08g/LCuCl2、0.08g/LNaWO4·2H2O和150mmol/LHCl组成。本专利技术中，所述维生素母液由500mg/L泛酸钙、300mg/L肌醇、500mg/L烟酸、500mg/L盐酸吡哆醇、300mg/L对氨基甲苯和0.8mg/L维生素B12组成。本专利技术中，所述基本培养基由基本培养液和琼脂组成。对上述方法所得到的菌株进行形态、培养特性和生理生化特性鉴定，具体步骤如下：将低温培养48小时的菌体进行革兰氏染色后在1000倍显微镜下观察菌体大小和菌体颜色；将菌液倍比稀释后涂布在基本培养基平板上，观察菌落形态和颜色；将液体菌液培养4-7天，观察有无色素产生；将菌株进行氧化酶、接触酶、精氨酸双水解酶、葡萄糖和蔗糖发酵，V.P、M.R和明胶液化试验。结果：形态特征：杆状，末端圆，有芽孢，大小为1.2～1.5μm×2.0～4.0μm；菌落圆形，在培养基上菌落乳白色(图1)。生理生化特征：革兰氏阳性好氧菌，氧化酶阴性，接触酶阴性，精氨酸双水解酶阴性，利用葡萄糖和蔗糖，V.P阳性，M.R阴性，液化明胶慢；生长温度为4～37℃，最适生长温度为25～30℃，生长pH值为5.0～11.0，最适生长pH值为7.0～8.0，C/N＝1～20，最适C/N＝12。对所得到的菌株进行16SrDNA序列分析：取4mL液体样品，分多次加入灭菌的2mL离心管中，10000rpm室温离心3min，弃置上层液体，倒置2mL管于吸水纸上1min，直至没有液体流出，获得总DNA，用细菌16SrDNA通用引物进行PCR扩增，将PCR产物进行琼脂凝胶电泳，回收大小在400bp以上的PCR产物，选用0.6倍的磁珠(AgencourtAMPureXP)处理，结果得到480bpDNA序列，利用软件RDPclas本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述方法步骤如下一、取80～120g含油土壤放入500mL三角瓶中，摇匀，静止至完全沉降；二、取上清液接入含有80～120mL基础培养液的250mL三角瓶中，25～35℃，150～200r/min富集培养5～10天；三、取1～5mL富集培养液接入含有100mL基本培养液的三角瓶中，3个平行样，20～40℃，150～200r/min震荡培养3～5天；四、将培养液倍比稀释至1000倍，取100μL培养液涂布在含基本培养基的固体平板上，将平板放在20～40℃培养箱中培养直至长出菌落；五、将单菌落划线纯化后进行低温氨氮降解试验，即可得到石油产品脱硫菌株。

【技术特征摘要】
1.一种石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述方法步骤如下一、取80～120g含油土壤放入500mL三角瓶中，摇匀，静止至完全沉降；二、取上清液接入含有80～120mL基础培养液的250mL三角瓶中，25～35℃，150～200r/min富集培养5～10天；三、取1～5mL富集培养液接入含有100mL基本培养液的三角瓶中，3个平行样，20～40℃，150～200r/min震荡培养3～5天；四、将培养液倍比稀释至1000倍，取100μL培养液涂布在含基本培养基的固体平板上，将平板放在20～40℃培养箱中培养直至长出菌落；五、将单菌落划线纯化后进行低温氨氮降解试验，即可得到石油产品脱硫菌株。2.根据权利要求1所述的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述基本培养液由6.0～10.0g/L葡萄糖、2.0～3.0g/LNH4Cl、6.0～7.0g/LKH2PO4、8.0～9.0g/LK2HPO4、0.2～0.4g/LMgCl2·6H2O、0.5～1.5mL/L微量元素溶液母液、0.5～1.5mL/L维生素溶液母液和余量的蒸馏水组成，总体积为100mL，121℃灭菌30min。3.根据权利要求1所述的石油产品脱硫巨大芽孢杆菌的筛选方法，其特征在于所述基本培养液由8.0g/L葡萄糖、2.5g/LNH4Cl、6.5g/LKH2PO4、8.5g/LK2HPO4、0.3g/LMgCl2·6H2O、1.0mL/L微量元素溶液母液、1.0mL/L维生素溶液母液和余量的蒸馏水组成，总体积为100mL，121℃灭菌3...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，张玥，王志成，马宁，
申请(专利权)人：黑龙江省能源环境研究院，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23