本发明专利技术公开了一种温度、酸度控制纤维素酶在巨大芽孢杆菌中表达的方法，属于基因工程领域。本发明专利技术方法包括如下步骤：将SEQ ID NO.1所示序列、SEQ ID NO.2所示序列通过限制性内切酶SmaI、XbaI及DNA连接酶分别连接到载体上构建同源重组质粒；将所构建的两个同源重组质粒转化巨大芽孢杆菌ATCC 14581，筛选同源重组成功的菌株。本发明专利技术以巨大芽孢杆菌为表达宿主，通过同源重组将纤维素外切酶基因和纤维素内切酶基因置于温度调控或酸调控元件下，实现了纤维素外切酶或内切酶的可控表达，从而能对黑曲霉纤维素酶进行定向复配，使纤维素外切酶、内切酶、葡糖苷酶达到合适的比例，提高纤维素催化效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种温度、酸度控制纤维素酶在巨大芽孢杆菌中表达的方法。
技术介绍
纤维素资源的利用，对地球的可持续发展具有重要的意义。纤维素酶在对生物资源的利用方面具有巨大的价值。纤维素酶能降解天然的纤维素，转化成葡萄糖，进而生产多种化工原料或生物制品。纤维素的降解一般在高温之下进行，然而现在纤维素酶的主要生产菌株一般不能耐受较高的温度，这样生产纤维素酶的菌株在生产纤维素酶应用的时候，都会因为过高的温度死亡。如果生产纤维素酶的菌株能够耐受较高的温度，那么可以实现一边降解纤维素，一边生产纤维素酶，从而维持纤维素酶较高的活性。嗜热的微生物中，芽孢杆菌能在高温下进行正常的生长繁殖，而且芽孢杆菌是一种食品安全的微生物。若用芽孢杆菌生产纤维素酶，这样芽孢杆菌不仅可以在高温下持续表达纤维素酶，而且不需要经过分离纯化把芽孢杆菌去除掉。巨大芽孢杆菌是较好的表达外源蛋白的宿主。黑曲霉是生产纤维素酶较好的菌株之一，黑曲霉产生的纤维酶活力高，安全性好。然而，黑曲霉产生的纤维素外切酶和内切酶相对于葡糖苷酶较低，使整个酶系的催化活力下降。在不同的条件下，黑曲霉纤维素外切酶和内切酶的酶活变化大，比如不同的发酵工艺、发酵培养基等条件下黑曲霉产生的纤维素外切酶和内切酶的酶活都不同。现在一般通过复配的办法改善黑曲霉的三种酶酶活的比例，从而提高催化效率。然而，复配的酶的纤维素外切酶或内切酶的活性对不同条件下生产的黑曲霉不是最适的。这就需要根据黑曲霉的三种酶的活性相对值来调整加入的纤维素外切酶或内切酶的活性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种温度、酸度控制纤维素酶在巨大芽孢杆菌中表达的方法。本专利技术的目的还在于提供一种表达纤维素酶的巨大芽孢杆菌工程菌。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种温度、酸度控制纤维素酶在巨大芽孢杆菌中表达的方法，包括如下步骤：将SEQ ID NO.1所示序列（用SmaI酶切）、SEQ ID NO.2（用XbaI酶切）所示序列通过限制性内切酶SmaI、XbaI及DNA连接酶分别连接到载体上构建同源重组质粒；将所构建的两个同源重组质粒转化巨大芽孢杆菌ATCC 14581，筛选同源重组成功的菌株。所述的载体优选为pHT01载体。一种表达纤维素酶的巨大芽孢杆菌工程菌，通过上述方法得到。通过调节外界的温度或酸度可以定向的控制该巨大芽孢杆菌纤维素外切酶或内切酶的表达。本专利技术以巨大芽孢杆菌为表达宿主，通过同源重组将纤维素外切酶基因和纤维素内切酶基因置于温度调控或酸调控元件下，实现了纤维素外切酶或内切酶的可控表达，从而能对黑曲霉纤维素酶进行定向复配，使纤维素外切酶、内切酶、葡糖苷酶达到合适的比例，提高纤维素催化效率。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。实施例11、材料巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）ATCC 14581，大肠杆菌DH5α，质粒pHT01，SEQ ID NO.1所示的DNA序列1（包含前段同源臂、酸性条件增强表达的启动子、信号肽编码序列、纤维素外切酶基因、后段同源臂）、SEQ ID NO.2所示的DNA序列2（包含前段同源臂、信号肽编码序列、纤维素内切酶基因、后段同源臂）。质粒提取试剂盒（B518188）购自上海生物工程股份有限公司。胶回收试剂盒（Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）、限制性内切酶和T4 DNA Ligase购自Takara公司。LB培养基：胰蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，氯化钠（NaCl） 10g/L。2、质粒pHT01的提取含有质粒pHT01大肠杆菌DH5α，在含氯霉素5mg/L的LB培养基中培养12h，培养温度为30℃，用质粒提取试剂盒（B518188）提取质粒。提取步骤如下：（1）取0.5mL菌液，10000rpm离心3min收集菌体，倒尽或吸干培养基。（2）在菌体沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振荡至彻底悬浮菌体，室温放置3min。（3）将裂解液全部小心移入吸附柱，室温放置1min，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（4）向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（5）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（6）重复向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm 离心1min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。（7）将吸附柱和收集管放入离心机，8000rpm离心2min。（8）将吸附柱放入干净的1.5mL离心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室温静置2min，8000rpm离心2min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存。3、质粒pHT01和SEQ ID NO.1、2所示DNA序列1、2的酶切往25µL提取的质粒pHT01中加入SmaI或XbaI酶各0.2µL，加入酶切缓冲液及ddH2O 24.6µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到质粒pHT01酶切液。合成的DNA序列1或2用双蒸水稀释10倍，取25µL，加入SmaI或者XbaI酶各0.2µL，加入酶切缓冲液及ddH2O 24.6µL，在30℃保温60min，加入5µL Loading Buffer，60℃保温10min，得到酶切液。4、酶切液电泳（1）电泳试剂配制1）5×TBE（tris-硼酸及EDTA）缓冲液的配制（1000mL）：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20mL，将pH调到8.0，定容至1000mL。4℃冰箱保存，用时稀释5倍。2）加样缓冲液的配制：0.25%溴酚蓝，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。3）溴化乙锭的配制：称取0.1g溴化乙锭，溶于10mL水，配成终浓度为10mg/mL的母液，4℃冰箱保存。染色时，吸取12.5μL的母液，加入250mL的水中，使其终浓度为0.5μg/mL，混合均匀。4）100×TE缓冲液的配制：1mol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L EDTA。称取Tris 121.1g，EDTA-Na 237.23g，先用800mL双蒸水，加热搅拌溶解后，再用盐酸调pH至8.0（大约加入盐酸20mL），然后定容至1000mL。5）100×电泳缓冲液的配制：4mol/L Tris-HCl（pH8.0），2mol/L醋酸钠，200mmol/L EDTA。称取Tris 242.2g，无水乙酸钠82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL双蒸水加热搅拌溶解后，再用冰乙酸调pH至8.0（大约加入冰乙酸50mL），然后定容至500mL。用时稀释100倍。（2）电泳方法1）安装电泳槽：将有机玻璃的电泳凝胶床洗净，晾干，用胶带将两端的开口封好，放在水平的工作台上，本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种温度、酸度控制纤维素酶在巨大芽孢杆菌中表达的方法，其特征在于：包括如下步骤：将SEQ ID NO.1所示序列、SEQ ID NO.2所示序列通过限制性内切酶SmaI、XbaI及DNA连接酶分别连接到载体上构建同源重组质粒；将所构建的两个同源重组质粒转化巨大芽孢杆菌ATCC 14581，筛选同源重组成功的菌株。
【技术特征摘要】
1.一种温度、酸度控制纤维素酶在巨大芽孢杆菌中表达的方法，其特征在于：包括如下步骤：将SEQ ID NO.1所示序列、SEQ ID NO.2所示序列通过限制性内切酶SmaI、XbaI及DNA连接酶分别连接到载体上构建同源重组质粒；将所构建...
【专利技术属性】
技术研发人员：薛栋升，梁龙元，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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