本发明专利技术公开了猪流行性腹泻S1蛋白融合基因及重组巨大芽孢杆菌和应用。本发明专利技术将猪流行性腹泻病毒S糖蛋白的S1抗原位点和细胞壁锚定序列连接得到SEQ?ID?No.1所示的抗原融合基因。本发明专利技术进一步的构建了含有该抗原融合基因的分泌表达载体，将其转化到巨大芽孢杆菌中在其细胞壁或其表面表达重组蛋白。免疫印迹试验表明，所表达的重组蛋白能够与PEDV免疫血清发生反应，表明本发明专利技术所制备的重组蛋白与PEDV天然抗原一样具有相同的抗原性。诱导表达后的活菌体免疫荧光试验表明，所表达的重组蛋白定位于菌体的表面。实验结果表明，本发明专利技术所制备的重组蛋白能够用于制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗原融合基因以及含有该抗原融合基因的重组菌株，尤其涉及猪流行性腹泻S1蛋白融合基因以及含有该融合基因的表达载体，本专利技术进一步涉及含有该表达载体的重组巨大芽孢杆菌菌株以及它们在制备防治猪流行性腹泻疫苗中的应用，属于猪流行性腹泻的防治领域。
技术介绍
猪流行性腹泻(PEDV)是由冠状病毒引起猪的一种急性高度接触性传染病，以水泻、呕吐和脱水为特征，该病在世界范围内广泛分布，危害严重，给养猪业带来重大经济损失。病毒主要通过肠道感染猪，具有明显的肠道组织嗜性的特点，在抗PEDV感染免疫过程中除体液免疫和细胞免疫外，局部肠粘膜免疫系统发挥着不可替代的作用。PEDV具有典型的冠状病毒结构，由4种主要结构蛋白组成，分别为磷酸化的核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)、糖基化的纤突蛋白(S)和小囊膜蛋白(E)其中S糖蛋白携带主要的B淋巴细胞抗原决定簇能够诱导产生中和抗体和提供免疫保护作用的重要结构蛋白，因此，S蛋白对病毒感染、发挥其致病性和决定宿主细胞亲嗜性方面起关键作用。PEDV感染具有明显的嗜肠性，分泌型IgA抗体是保护猪体不受PEDV感染和免于发病的关键因素，口服免疫后，在肠液和血清中均可检出slgA抗体，而非口服途径接种则检测不到slgA。仔猪可通过初乳获得母源slgA，产生对流行性腹泻的被动免疫保护。常规的灭活疫苗和弱毒疫苗在防治这两种疾病中起到了积极作用，取得良好的效果，但是仍然存在一些问题，如灭活疫苗免疫原性差，不能有效诱导slgA，抵抗感染；弱毒疫苗接种后的动物机体排散病毒、病毒毒力可能返强等，另外必须通过注射途径免疫。针对猪流行性腹泻的特点，采用口服免疫是较为理想的预防途径，但是如何避免胃肠道对抗原的破坏并有效诱导免疫应答成为关键。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因及其编码的蛋白；本专利技术的目的之二是提供含有上述猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因的表达载体；本专利技术的目的之三提供含有上述表达载体的重组宿主菌株。为了实现上述目的，本专利技术一方面提供了一种由PEDV糖蛋白S的S1抗原位点与化脓链球菌细胞壁锚定序列(CWAm6)连接得到的融合基因，其多核苷酸序列为SEQID N0.1所示。本专利技术根据Genbank登录的PEDV全基因序列AF353511，找出编码S糖蛋白的22-505aa段序列，通过柔性的Linker ((GGGGS) 3)将PEDV的S1抗原位点基因和细胞壁锚定序列(CWAm6)连接起来，将该序列命名为MLS1 (SEQ ID N0.1)。考虑到巨大芽孢杆菌密码子的偏嗜情况，本专利技术为了提高异源基因在宿主菌中的表达，并保证翻译后的氨基酸不变的情况下，对稀有密码子苏氨酸(ACG)、组氨酸(CAC)、精氨酸(CGG、CGA)、丙氨酸(GCG)和亮氨酸(CTC、CTG)等进行改变。此外，在MLS1的上游和下游分别引入Bgl II酶切位点和SphI酶切位点。本专利技术的另一方面是提供由SEQ ID N0.1所示融合基因编码的蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID N0.2所示。。本专利技术的又一方面是提供含有所述猪流行性腹泻S1蛋白融合基因的表达载体；例如，将本专利技术SEQ ID N0.1所示的抗原融合基因与表达载体PHIS1525进行可操作性的连接，得到可以在巨大芽孢杆菌的外表面或其细胞壁表达融合基因的分泌表达载体。针对PEDV经黏膜感染和slgA在抵抗疾病中具有重要作用的特点，本专利技术构建了表达PEDV S1蛋白的重组巨大芽孢杆菌表达系统，作为一种口服疫苗，通过刺激肠道黏膜免疫系统产生的特异性slgA，达到阻止病原感染的目的。由此，本专利技术的再一方面是提供一株表达猪流行性腹泻SI蛋白融合基因的重组巨大芽孢杆菌菌株，能够用其制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。本专利技术将SEQ ID N0.1所示的融合基因与分泌表达载体pHIS1525进行双酶切、连接并经原生质体转化转入宿主菌巨大芽孢杆菌WH320细胞，获得含有重组质粒的重组巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)菌株(WH320-PHIS1525-MLSJ ;其微生物保藏号是:CCTCC No:M2011445 ;分类命名是:巨大芽孢杆菌 WHSZO-pHISlSZS-MLSi (Bacillusmegaterium WH320-PHIS1525-MLSD ;保藏时间是2011年12月5日；保藏单位是:中国典型培养物保藏中心；保藏地址是:中国武汉武汉大学。进一步的，本专利技术将重组巨大芽孢杆菌菌株(WH320-PHIS1525-MLSJ用加入终浓度为0.2%木糖进行诱导，使融合基因在菌体表面进行表达；免疫印迹实验表明，所表达的重组蛋白能够与TGEV免疫血清发生反应，表明重组蛋白与TGEV天然抗原一样具有相同的抗原性，能够用于制备成防治猪流行性腹泻的安全、有效的粘膜免疫活菌疫苗。间接免疫荧光检测也证实表达蛋白存在于菌体上，诱导表达后的活菌体免疫突光试验表明，所表达的蛋白初步定位于菌体的表面，存在菌体表面的目的蛋白，为抗原物质有效刺激免疫系统，提高抗体水平奠定了重要的物质基础。本专利技术在实验设计上以阻断肠道传染病疾病病原感染的第一道防线为目的，使用安全无毒的巨大芽孢杆菌表达系统，巨大芽孢杆菌不产细胞内毒素，不产胞外碱性蛋白酶，有利于所表达蛋白的稳定积累，质粒稳定，可以稳定高效地表达蛋白，比较适合工业化发酵生产。同时芽孢杆菌在肠道定植后，能消耗大量的游离氧，造成厌氧环境，可减少需氧菌对肠道的定植。也有利于乳酸杆菌和双歧杆菌等厌氧菌的生长，致使体内的有益菌增加而致病菌减少，保持肠道微生态系统平衡。为了检验本专利技术重组巨大芽孢杆菌或该重组巨大芽孢杆菌所表达的融合蛋白MLSJt为防治猪传染性胃肠炎口服疫苗的可行性，本专利技术将构建的重组巨大芽孢杆菌WH320-PHIS1525-MLS! 口服免疫小鼠，不同时间测定肠道粪便中特异性抗体slgA的水平；试验结果发现，重组巨大芽孢杆菌ΙΗ320-ρΗΙ31525-ΜΙΑ在连续3次免疫后诱导小鼠产生了明显的抗PEDV-S蛋白的分泌性slgA抗体反应。重组菌组后期采样抗体一直上升，各时间点采样抗体水平均明显高于免疫之初及对照菌(免疫空载体转化菌WH320-pHIS1525)组和PBS组(p〈0.05)，重组菌组38d时抗体水平达到顶峰(p〈0.05)，之后下降，至60d时抗体水平仍明显高于对照组(P〈0.05)。试验结果表明，本专利技术所构建的重组巨大芽孢杆菌或所表达的融合蛋白MLS1能有效的刺激小鼠肠道免疫系统产生特异性免疫应答，能将其制备成防治猪传染性胃肠炎的口服疫苗。本专利技术所涉及到的术语定义除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本专利技术所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本专利技术的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。术语“重组宿主菌株”或“宿主细胞”意指包含本专利技术多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。术语“多核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核本文档来自技高网...
【技术保护点】
猪流行性腹泻S1蛋白抗原融合基因，其特征在于：其多核苷酸序列为SEQ?IDNo.1所示。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张金林，马立保，胡晓芬，
申请(专利权)人：武汉华扬动物药业有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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