本发明专利技术涉及微生物菌剂技术领域，具体涉及一种巨大芽孢杆菌T482及其菌剂和菌剂制备方法，所述巨大芽孢杆菌T482保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015754。所述的菌剂制备方法，包括以下步骤：（1）分离、筛选；（2）纯化、保存；（3）固体发酵培养；（4）菌剂制备，即得到巨大芽孢杆菌T482菌剂。本发明专利技术的巨大芽孢杆菌T482具有高效的固氮酶活性和分泌IAA能力，其固氮酶活性为1000～1200 nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为200～300 mg/L，其作为一种新的微生物菌剂，在农业生产中，具有良好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物菌剂
，具体涉及一种巨大芽孢杆菌T482及其菌剂和菌剂制备方法。
技术介绍
化肥的有效供应是农业可持续发展的基本保证之一，但伴随着化肥特别是氮肥的大量使用，在满足作物高产需要的同时，带来的化肥报酬率递减、土壤物理性状恶化和水资源污染等负面效应已不容忽视。由于传统化肥应用伴随着种种弊端，因此研制出一种可以降低其用量而且符合农业可持续发展要求的新型肥料就显得十分必要了。当前，作为一项新的农业措施，施用微生物肥料在发展高产、高效、优质农业和生产绿色食品、保护农业生态环境中的作用已引起国内外学者的高度重视。生物固定的氮量在整个自然界的固氮量中占有很高的比例已经被大量的研究证实，一般是非生物固氮的两倍多，利用生物固氮这一重要途径来提供氮肥给农业生产带来了良好的经济效益、无污染等好处。巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)是一种好氧产孢革兰氏阳性细菌，至今已有一百多年的研究历史。近年来，随着微生物肥料的研究，巨大芽孢杆菌作为解磷菌被广泛应用于解磷细菌肥料生产。目前，国内对巨大芽孢杆菌在微生物肥料上的研究主要集中在菌株选育、解磷效果、发酵条件优化及与解钾菌相互作用等方面，而对巨大芽孢杆菌的固氮作用却不多见。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌T482，其具有固氮酶活性和分泌生长素吲哚乙酸的功能。本专利技术的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌T482菌剂，其具有较高的固氮酶活性且能分泌生长素，农业应用范围广，经济效益高。本专利技术的另一目的是针对现有技术中的上述不足，提供一种巨大芽孢杆菌T482菌剂制备方法，工艺简单成熟，可规模化生产。本专利技术的目的通过以下技术方案实现。一种巨大芽孢杆菌T482，所述巨大芽孢杆菌T482保藏于中国典型培养物保藏中心(China Center for Type Collection)，地址为中国武汉大学，分类号为巨大芽孢杆菌T482 Bacillus megateriumT482保藏号为CCTCCM 2015754，保藏日期为2015年12月15日。所述巨大芽孢杆菌T482具有序列表NO.1的DNA序列。所述巨大芽孢杆菌T482的固氮酶活性为1000～1200nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中可以产生吲哚乙酸，吲哚乙酸的分泌量为200～300mg/L。一种巨大芽孢杆菌T482的菌剂制备方法，包括以下步骤：(1)分离、筛选选取含有巨大芽孢杆菌T482的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；(2)纯化、保存在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行划线纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌T482单菌落，保存该单菌落备用；巨大芽孢杆菌T482单菌落如图1所示。具体地，在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养36-48小时分离得到巨大芽孢杆菌T482单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养36-48小时，置于4℃冰箱中保存。(3)固体发酵培养选取上述巨大芽孢杆菌T482单菌落，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1-7.4，接种量0.5-1.0％，培养温度为30-37℃，培养时间为48-60小时；(4)菌剂制备将固体发酵培养后的产物于30-50℃烘干后用小型粉碎机打碎，设定最终产品活菌数为5亿/g，进行检测，检测结果显示该活菌数范围是3-8亿/g，产品活菌数完全符合国家标准《微生物菌剂》GB20287-2006要求2亿/g以上，得到巨大芽孢杆菌T482菌剂，即可包装成成品。影响微生物生长繁殖的环境因素有很多，对发酵影响较大的有pH、接种量、培养温度和培养时间。pH是微生物生长和产物合成的非常重要的影响参数，是衡量代谢活动的综合指标。pH的变化会影响到各种酶活、菌对基质的利用速率和细胞的构造，从而影响菌的生长和产物的合成。在巨大芽孢杆菌T482发酵过程中，通过补酸或者补碱的方法调节pH为7.1-7.4。适当的接种量可调节培养液黏度和溶解氧含量，缩短生长达到高峰的时间、使产物提前合成。巨大芽孢杆菌T482的接种量设定为0.5-1.0％。微生物的生长和产物的合成均需要在其各自最合适的温度下进行。温度是保证酶活的重要条件，故在发酵过程中必须保证最适的温度环境。巨大芽孢杆菌T482的固体发酵温 度最佳为30-37℃。根据巨大芽孢杆菌T482在摇瓶中的生长情况，设定培养时间48-60小时为发酵终点。所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮65-72份，豆粕22-28份，NaCl 3-4份，CaCO3 1.5-2.5份，MnSO4·H2O 0.01-0.04份，MgSO4·7H2O 0.01-0.05份，调节培养基的pH为7.1-7.4。优选地，所述步骤(3)固体发酵培养中，培养基由以下重量份的原料组成：麸皮69份，豆粕25份，NaCl 3.6份，CaCO3 2.0份，MnSO4·H2O 0.02份，MgSO4·7H2O 0.02份，培养基的pH为7.1-7.4。该固体发酵培养有利于提高产孢量，促进作物的生长，降低生产成本。所述步骤(1)分离、筛选的具体方法为：选取土样，加入含吐温80的无菌水，震荡，静置，取上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，再加入含吐温80的无菌水悬浮，离心，去沉淀，再将上清液离心，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；取上述样品液与磷酸缓冲液悬浮混合，得到稀释菌悬液；将稀释的菌悬液水浴加热，自然冷却后吸取涂布于无氮培养基，培养获得固氮菌菌落。更具体地，分离、筛选的方法为：从广东省东莞市常平镇黄泥塘农场采取500g土样，加入3L含0.01％吐温80的无菌水，震荡10min，静置半个小时，取上清液于20℃下8000rpm离心20min。弃上清液，保留沉淀物，加入30-50mL含0.01％吐温80的无菌水悬浮，液体于20℃下5000rpm离心5秒钟，去沉淀，将上清液倒入一个干燥无菌的离心管中于20℃下4820rpm离心10min，弃上清液，保留沉淀物，将沉淀物用10mL的pH 7.0磷酸缓冲液悬浮，得到样品液；取1mL上述样品液与9mL磷酸缓冲液悬浮混合，即为10倍稀释菌悬液。将稀释的菌悬液置于75℃水浴加热15min，自然冷却后吸取100μL涂布于无氮培养基，30℃培养36-48小时获得含巨大芽孢杆菌T482的固氮菌菌落。所述步骤(1)中，分离筛选培养基由以下质量的原料制成：CaCO3 1.0-1.4g，MgSO4·7H2O 0.6-1.2g，K2HPO4 1.0-2.0g，NaCl 0.1-0.4g，FeSO4·7H2O 0.001-0.005g，NaMO4·2H2O 0.05-0.1g，蔗糖5-10g，琼脂18-20g，蒸馏水1000ml，pH7.1-7.4。本专利技术的分离筛选培养基属于改良无氮培养基，培养效果好。所述纯化保存的具体方法为：在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养36-48小时分离得到枯草芽孢杆菌T482单菌落。将平板上出现的单菌落保存在试管中继续30℃恒温培养36-48小时，置于4℃冰箱中保存。巨大芽孢杆菌T482 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种巨大芽孢杆菌T482，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T482保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015754。
【技术特征摘要】
1.一种巨大芽孢杆菌T482，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T482保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCM 2015754。2.根据权利要求1所述的一种巨大芽孢杆菌T482，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T482具有序列表NO.1的DNA序列。3.根据权利要求1所述的一种巨大芽孢杆菌T482，其特征在于：所述巨大芽孢杆菌T482的固氮酶活性为1000～1200 nmol/(mL·h)，其在生长代谢过程中吲哚乙酸的分泌量为200～300 mg/L。4.权利要求1-3任意一项所述的一种巨大芽孢杆菌T482的菌剂制备方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）分离、筛选选取含有巨大芽孢杆菌T482的固氮菌菌落的土样，经分离筛选培养基培养得到固氮菌菌落；（2）纯化、保存在培养基上将分离、筛选获得的固氮菌菌落进行纯化，培养分离得到巨大芽孢杆菌T482单菌落，保存该单菌落备用；（3）固体发酵培养选取上述巨大芽孢杆菌T482单菌落，用固体培养基进行培养，发酵环境pH为7.1-7.4，接种量0.5-1.0%，培养温度为30-37℃，培养时间为48-60小时；（4）菌剂制备将固体发酵培养后的产物烘干后打碎，活菌数检测的检测结果显示该活菌数范围是3-8亿/g，即得到巨大芽孢杆菌T482菌剂。5.根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T482的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（2）纯化、保存的具体方法为：在纯化保存培养基上将分离、筛选获得的菌落进行划线纯化，30℃恒温培养36-48小时分离得到巨大芽孢杆菌T482单菌落，将平板上出现的单菌落保存在试管中，30℃恒温培养36-48小时，置于4℃冰箱中保存。6.根据权利要求4所述的一种巨大芽孢杆菌T482的菌剂制备方法，其特征在于：所述步骤（3）固体发酵...
【专利技术属性】
技术研发人员：王亚君，杨国平，林敏，孙旭生，杨盼盼，尹坤，张学贤，沈世华，陈三凤，谭志远，燕永亮，
申请(专利权)人：东莞市保得生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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